靶向HPV E6E7基因的TALEN的构建及应用研究

发布时间：2021-04-19 11:08

研究目的： 1.分析HPV16/18E6/E7癌基因序列信息,构建靶向于HPV16/18E6/E7不同靶点的TALEN质粒,利用体外的报告系统初步筛选出切割效率最好而毒副作用最小的TALEN;同时对TALEN的FokI切割域和骨架系统进行优化,筛选出切割效率最高的的TALEN。 2.再将TALEN应用到各种细胞系中,从E6E7DNA拷贝数的变化、细胞内靶序列的切割效率、癌蛋白表达情况、细胞凋亡以及细胞增殖等方面验证TALEN的细胞内效应和特异性。 3.以mRFP表达建立小鼠阴道内转染体系,评价阴道内转染质粒的基因表达、分布等情况,再以靶向EGFP的TALEN质粒(TAL-EGFP)转染到系统表达EGFP的转基因小鼠阴道内,利用EGFP荧光表达评价阴道内转染TALEN的作用效果,以此优化转染体系,为后续在转基因小鼠阴道内直接转染靶向HPV的TALEN表达质粒治疗CIN或宫颈癌建立基础,为CIN或宫颈癌的治疗与预防提供新的策略。研究方法： 1.分析高危性HPV16和HPV18的E6E7癌基因序列,在E6E7癌基因翻译起始点或主mRNA剪接体的起始外显子之内挑选出作用靶点,利用Golden Gate Assembly的方法构建TALEN质粒共计16对,随后利用SSA reporter报告系统对所有的TALEN进行筛选；突变野生型的FokI切割域,将FokI突变体和两种TALEN骨架进行组合并同样用SSA reporter系统筛选效率最高毒副作用最小的组合方式进行组装优化。 2.将优化的TALEN分别转入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T细胞系,利用T7E1实验检测细胞内DSB用于间接反应TALEN在细胞内的切割效率;荧光原位杂交技术检测细胞内HPV E6E7基因的拷贝数变化;Western blotting检测HPV16/18E6E7癌基因及其下游基因的蛋白表达情况；流式细胞术检测细胞凋亡；CCK-8实验检测细胞增殖情况。 3.采用单次或多次不同剂量给药的方式在小鼠阴道内直接转染mRFP表达质粒,小鼠阴道脱落细胞直接镜下观察细胞发光情况,监测转染效率；选取不同给药剂量的不同时间点处死小鼠,取出小鼠宫颈阴道部组织,冰冻切片观察红色荧光在组织内的分布情况,优化阴道内转染的条件；再按照此条件在EGFP转基因小鼠阴道内转染FLAG标记的靶向EGFP的TAL-EGFP,取组织冰冻切片观察EGFP绿光变化情况,再用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋切片,通过携带的FLAG标签的免疫组化染色确定TAL-EGFP质粒的表达在组织内的分布情况。通过HE染色和小鼠CD45的免疫组化染色确定转染是否诱导局部的炎症。研究结果： 1.经过SSA reporter系统的筛选,所有构建的16对TALEN质粒均能有效的切割DNA,切割效率最好的分别是靶向于HPV16E6的T27,靶向于HPV16E7的T512,靶向于HPV18E6的T34和靶向于HPV18E7的T519；+63截短型骨架与S+KKR/ELD的突变型Fokl的组合的切割效率最高,因此将上述4对TALEN质粒全部装上这一骨架系统。 2.将优化的4对TALEN分别转入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T细胞后,(1)T7E1实验检测经T27或T512处理的SiHa和S12细胞、T34或T519转染的HeLa细胞样品均得到阳性的结果。(2)荧光原位杂交技术检测发现T512转染后的SiHa和S12细胞里的HPV16DNA拷贝数降低,T519处理后的HeLa细胞里的HPV18DNA拷贝数降低。(3) Western blotting结果显示T27、T34能特异性的诱导HPV16E6和HPV18E6蛋白的下调,同时检测到E6下游的靶蛋白p53的上调；T512、T519能特异性的诱导HPV16E7和HPV18E7蛋白的下调,以及E7下游的CDK2蛋白的表达上调。(4)细胞凋亡结果显示T27和T512仅能引起HPV16阳性的细胞系SiHa和S12的明显凋亡,对HPV18阳性的HeLa无明显诱导凋亡作用；T34和T519仅能引起HeLa的凋亡,而对SiHa无明显作用；所有这4对TALEN对HPV阴性的宫颈癌细胞系C33A和正常人胚肾细胞系293T都无诱导凋亡作用。(5)细胞增殖实验显示,T27和T512仅特异性的抑制SiHa和S12的细胞增殖,对HeLa、C33A、293T的生长无明显抑制作用；T34和T519仅特异性的抑制HeLa的增殖,对其他4株细胞系均无明显影响。 3. mRFP质粒在小鼠阴道内转染后48小时即可检测到明显的发光情况,并且至少6天内可观察到荧光；通过比较不同浓度不同转染量的发光情况,对阴道内转染体系进一步的优化；观察到转染的质粒表达范围大部分限定在宫颈和阴道的上皮内；阴道内转染的TAL-EGFP可以在体内有效的切割EGFP表达序列,阻止EGFP转基因小鼠阴道内的EGFP蛋白的继续表达,使得宫颈阴道局部的EGFP荧光减弱甚至消失；证明体内转染质粒对局部无损伤,不会诱导急性炎性反应。研究结论： 1.对构建出8对靶向于HPV16E6E7和8对靶向于HPV18E6E7的TALEN质粒进行筛选后得出效果最好的4对分别是靶向于HPV16E6的T27,靶向于HPV16E7的T512,靶向于HPV18E6的T34和靶向于HPV18E7的T519,并对FokI切割域和骨架系统进行了优化。 2.T27、T512、T34和T519在相应HPV阳性的细胞内有效的切割靶向HPV序列,引起HPV拷贝数的降低,相应HPV癌基因表达的下调以及下游p53或RB1通路的上调,最终诱导细胞的凋亡,抑制细胞的增殖,而对其他HPV亚型阳性的细胞或HPV阴性的细胞无作用。 3.小鼠阴道内转染TALEN质粒可以有效到达小鼠宫颈局部组织,有效地切割宫颈上皮组织内的靶向序列,阻碍目的蛋白的表达。并且小鼠阴道内转染不引起阴道局部的急性炎症反应,对局部组织无损伤,可以用于宫颈局部的基因治疗。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.33

文章目录

中英文缩略词表

中文摘要

Abstract

研究背景

参考文献

第一部分靶向HPV16/18 E6/E7的TALEN质粒的构建及筛选

摘要

Abstract

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分靶向于HPV16/18 E6E7的TALEN的效应的验证

摘要

Abstract

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分小鼠阴道内转染体系的建立及阴道内应用TALEN的效应验证

摘要

Abstract

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

综述 TALEN技术在靶向基因治疗中的应用

参考文献

附录

致谢

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