PGE2上调THP-1巨噬细胞VEGF表达并促进血管新生活动的实验研究

发布时间：2018-09-19 16:29

【摘要】：研究背景和目的随着生育年龄的推后,环境污染和生活压力增大,不孕症的发生率呈现一个上升的趋势。近年来,体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)及其相关的衍生技术快速发展及其在临床的广泛应用使得众多不孕不育患者有机会获得了后代。IVF-ET成功的关键环节就是胚胎的成功着床。辅助生殖中总体妊娠率徘徊在40%-60%[1]左右,但是不少夫妇反复多次助孕后仍然失败,经济和精神都受到巨大的压力,临床医生也沮丧不已。2005年从Thomhill提出反复着床失败(repeated implantation failure,RIF)[2]的定义到后来 Margaliothle等学者提出还需考虑胚胎期别和患者年龄[3],至今大多数学者采用的RIF定义是:移植3次以上优质胚胎或者多次移植胚胎数量共计≥ 10枚后仍未能获得临床妊娠。RIF已经成为辅助生殖中提高妊娠率的瓶颈问题,如何改善这类不孕患者的助孕结局,提高胚胎着床的成功率成为了我们亟待解决的问题。南方医院生殖中心体外受精-胚胎移植的反复着床失败的发生率约为7～11%[4],全松等认为原因有如下几个方面:胚胎质量不良、移植技术缺陷、子宫内膜容受性不良、精神心理因素及不明原因。其中约2/3的反复着床失败是由于子宫内膜容受性不良导致的[5,6]。因此,研究改善如何围着床期子宫内膜的容受性及其相关机制,成为了反复着床失败的研究热点,对于提高RIF助孕患者的妊娠率具有重要的意义。人类育龄期妇女的生殖系统存在生理性血管生成,对生殖系统的生长发育和基本功能的至关重要[7,8],而既往对子宫内膜组织学的研究发现,围着床期过程中子宫内膜局部生理性血管新生活动处于高峰是围着床期生殖系统发生的最显著性标志之一。巨噬细胞是一种古老的免疫细胞,在固有免疫和适应性免疫反应中都起着关键性的作用,是炎性反应中主要的调节细胞[9]。巨噬细胞功能广泛,有经典免疫学中的吞噬作用、抗原提呈作用以及杀菌作用,还能分泌多种细胞因子在不用的组织内环境产生不同的作用[10-12]。近年来,有学者发现,巨噬细胞除了经典的免疫功能外,还有着一些新的功能例如促进血管形成和血管重建等[13],提示巨噬细胞也可能参与胚胎着床的发生。本课题前期研究运用了大鼠NR8383巨噬细胞株进行研究表明PGE2是通过调节大鼠NR8383巨噬细胞生成VEGF,并且可能进而调控其对血管新生的活动[14]。但是人巨噬细胞的相关机制尚未见报道。本课题选取THP-1巨噬细胞及其促血管新生的作用作为切入点,通过研究THP-1巨噬细胞如何上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达及其调控的机制探讨其相关的促血管生成作用,为RIF的临床治疗提供实验依据。第一章PGE2上调THP-1巨噬细胞VEGF表达的机制研究第一节PGE2上调THP-1巨噬细胞VEGF表达目的:为了研究在女性生殖系统中发挥关键作用的巨噬细胞是可能通过何种机制调节促血管生成的作用,我们采用了 THP-1巨噬细胞进行了体外细胞学实验,通过Western Blot的方法检测THP-1巨噬细胞内促血管生成因子VEGF蛋白表达水平,初步探讨PGE2能否促进THP-1巨噬细胞合成VEGF的表达。方法:1.细胞培养和诱导选取生长良好的人单核细胞株THP-1细胞,PMA诱导细胞贴壁形成典型的巨噬细胞即为THP-1巨噬细胞。2.Westernblotting检测PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的影响。选取状态良好的THP-1巨噬细胞,分组为:空白处理组、1μmol/LPGE2组、10μmol/LPGE2组,处理THP-1巨噬细胞24小时后,提取细胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表达。3.SPSS 20.0软件对数据处理分析,结果用均数±标准差表示,多样本均数比较应用方差分析,方差齐选用LSD方法,方差不齐则用Duimett T3法,结果:与空白对照组相比,1μmol/LPGE2组THP-1巨噬细胞内的VEGF蛋白表达明显升高(P0.05);与与空白对照组相比,10μmol/LPGE2组THP-1巨噬细胞内的VEGF蛋白表达明显升高(P0.05);与1μmol/LPGE2组相比,10μmol/L PGE2组THP-1巨噬细胞内的VEGF蛋白表达亦有明显升高(P0.05)。结论:PGE2能有效上调THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白的表达。并且,PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的促进作用与呈浓度-梯度效应。第二节PGE2上调THP-1巨噬细胞VEGF表达的通路研究目的:采用了 PGE2的特异性受体拮抗剂(EP2拮抗剂AH6809或EP4拮抗剂AH23848)或cAMP-PKA通路的特异性抑制剂(腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536或PKA抑制剂H89)预处理后再予PGE2刺激THP-1巨噬细胞,通过Western Blot的方法检测THP-1巨噬细胞内VEGF蛋白表达水平,进一步探讨PGE2调控THP-1巨噬细胞合VEGF表达的机制。方法:1.细胞培养和诱导选取生长良好的人单核细胞株THP-1细胞,PMA诱导细胞贴壁形成典型的巨噬细胞即为THP-1巨噬细胞。2.Westemblotting检测PGE2上调THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的通路研究。选取状态良好的THP-1巨噬细胞,予PGE2的特异性受体拮抗剂(EP2拮抗剂AH6809或EP4拮抗剂AH23848)预处理后再予PGE2刺激THP-1巨噬细胞,提取细胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表达。选取状态良好的THP-1巨噬细胞,予cAMP-PKA通路的特异性抑制剂(腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536或PKA抑制剂H89)预处理后再予PGE2刺激THP-1巨噬细胞,提取细胞全蛋白,Western Blot分析VEGF蛋白的表达。3.SPSS 20.0软件对数据处理分析,结果用均数±标准差表示,多样本均数比较应用方差分析,方差齐选用LSD方法,方差不齐则用Duimett T3法,P0.05认为差异具有统计学意义。结果:EP2拮抗剂能抑制PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的上调作用,而EP4则无影响。腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和PKA抑制剂H89均能抑制PGE2对THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达的上调作用。结论:PGE2是通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白的表达。第二章PGE2增强THP-1巨噬细胞促进体外血管新生的影响第一节PGE2影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的迁移能力目的:上述实验初步证明了 PGE2通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞VEGF蛋白的表达,从而提示了 PGE2可能是通过上调了 THP-1巨噬细胞株的VEGF表达从而增强其促血管生成作用。因此我们采用了体外细胞学实验—Transwell细胞迁移实验和Matrigel体外成管实验,予不同处理THP-1巨噬细胞后,取细胞培养上清处理HUVECs,观察HUVECs迁移的数目,验证PGE2是否可以影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的迁移能力以及其影响的可能机制。方法:1.细胞培养和诱导选取生长良好的人单核细胞株THP-1细胞,PMA诱导细胞贴壁形成典型的巨噬细胞即为THP-1巨噬细胞。2.体外血管生成实验检测PGE2对THP-1巨噬细胞株促进HUVECs迁移能力的影响。选取状态良好的THP-1巨噬细胞,分组为:空白处理组:不予任何处理1 μmol/L PGE2 组:1μmol/L PGE2 处理 THP-1 巨噬细胞 24h 10μmol/L PGE2组:10μmol/L PGE2 处理 THP-1 巨噬细胞 24hAH6809+ PGE2 组:10μmol/L AH6809 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理THP-1巨噬细胞23hAH23848+ PGE2 组:10μmol/L AH23848 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理THP-1巨噬细胞23hSQ22536+ PGE2 组:30μmol/L SQ22536 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理THP-1巨噬细胞23hH89++ PGE2 组:10μmol/L H89 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理 THP-1巨噬细胞23h上述各组处理的细胞培养上清弃去,PBS洗涤细胞后继续无血清基础培养基裴洋8h后取细胞培养上清处理HUVECs,分别以Transwell细胞迁移实验观察不同处理下HUVECs迁移数目差异,从而研究PGE2对THP-1巨噬细胞株促进体外血管生成的影响3.SPSS 20.0软件对数据处理分析,结果用均数±标准差表示,多样本均数比较应用方差分析,方差齐选用LSD方法,方差不齐则用Duimett T3法,结果:与空白对照组相比,1μmol/LPGE2组HUVECs迁移数目增多(P0.05);与空白对照组相比,10μmol/LPGE2组HUVECs迁移数目也明显增多(P0.05);与 1 μmol/LPGE2 组相比,10μmol/LPGE2 组 HUVECs 迁移数目增多(P0.05);AH6809+ PGE2 组的 HUVECs 迁移数目较10μmol/L PGE2 组的少(P0.05),AH23848+ PGE2的HUVECs迁移数目与10μmol/LPGE2组相比无统计学差异;SQ22536+ PGE2 组和 H89++ PGE2 组的 HUVECs 迁移数目与10μmol/LPGE2 组相比均减少(P0.05)。结论:1.PGE2处理THP-1巨噬细胞能增强HUVECs迁移能力。PGE2处理THP-1巨噬细胞后,能明显增强HUVECs迁移的能力。其增强的能力与PGE2呈浓度-梯度效应,这与Westemblot的结果相一致。2.PGE2处理THP-1巨噬细胞能增强HUVECs迁移能力的机制。EP2拮抗剂AH6809、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和PKA抑制剂H89均能抑制PGE2增强THP-1巨噬细胞能促进HUVECs迁移能力,提示PGE2通过EP2和cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞增强HUVECs的迁移能力。第二节PGE2影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的体外成管能力目的:上述实验初步证明了 PGE2通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞VEGF蛋白的表达,从而提示了 PGE2可能是通过上调了 THP-1巨噬细胞株的VEGF表达从而增强其促血管生成作用。因此我们采用了 Matrigel体外成管实验,予不同处理THP-1巨噬细胞后,取细胞培养上清处理HUVECs,观察HUVECs的体外成管面积,验证PGE2是否可以影响THP-1巨噬细胞促进HUVECs的体外成管能力以及其影响的可能机制。方法:1.细胞培养和诱导选取生长良好的人单核细胞株THP-1细胞,PMA诱导细胞贴壁形成典型的巨噬细胞即为THP-1巨噬细胞。2.体外血管生成实验检测PGE2对THP-1巨噬细胞株促进HUVECs体外成管能力的影响。选取状态良好的THP-1巨噬细胞,分组为:空白处理组:不予任何处理11μmol/LPGE2 组:1μmol/LPGE2 处理 THP-1 巨噬细胞 24h 1 0μmol/L PGE2 组:1 0μmol/L PGE2 处理 THP-1 巨噬细胞 24hAH6809+ PGE2 组:10μmol/L AH6809 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理THP-1巨噬细胞23hAH23848+ PGE2 组:10μmol/L AH23848 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理THP-1巨噬细胞23hSQ22536+ PGE2 组:30μmol/L SQ22536 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理THP-1巨噬细胞23hH89++ PGE2 组:10μmol/L H89 预处理 1h 后加 10μmol/L PGE2 处理 THP-1巨噬细胞23h上述各组处理的细胞培养上清弃去,PBS洗涤细胞后继续无血清基础培养基裴洋8h后取细胞培养上清HUVECs,分别以Matrigel实验观察不同处理下HUVECs体外成管面积的差异,从而研究PGE2对THP-1巨噬细胞株促进体外血管生成的影响。3.SPSS 20.0软件对数据处理分析,结果用均数±标准差表示,多样本均数比较应用方差分析,方差齐选用LSD方法,方差不齐则用Duimett T3法,结果:与空白对照组相比,1μmol/LPGE2组HUVECs成管面积增大(P0.05);与空白对照组相比,10μmol/LPGE2组HUVECs成管面积增大(P0.05);与1μmol/L PGE2组相比,10μmol/L PGE2组HUVECs成管面积也明显增大(P0.05);AH6809+ PGE2 组的 HUVECs 成管面积较 10μmol/L PGE2 组的小(P0.05),AH23848+ PGE2的HUVECs成管面积与10μmol/L PGE2组相比无统计学差异;SQ22536+ PGE2组和H89+ PGE2组的HUVECs迁移数目与10μmol/L PGE2组相比均减小(P0.05)。结论:1.PGE2处理THP-1巨噬细胞能增强HUVECs体外成管能力。PGE2处理THP-1巨噬细胞后,能明显增强HUVECs体外成管的能力。其增强的能力与PGE2呈浓度-梯度效应,这与Westemblot的结果相一致。2.PGE2处理THP-1巨噬细胞能增强HUVECs体外成管能力的机制。EP2拮抗剂AH6809、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536和PKA抑制剂H89均能抑制PGE2增强THP-1巨噬细胞能促进HUVECs体外能力,这和Westemblot的结果以及Transwell的结果相一致,因此证明PGE2通过EP2-cAMP-PKA通路调控THP-1巨噬细胞株VEGF蛋白表达进而调节血管生成功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R714.8

【参考文献】