胎儿染色体异常与适宜产前诊断技术研究

发布时间：2018-10-10 20:46

【摘要】：第一部分孕中期高风险胎儿异常染色体分布的研究内容12001-2010年浙江省高风险胎儿的羊水染色体核型分布研究研究目的：了解浙江省孕中期高风险胎儿的染色体异常分布情况研究方法：回顾收集2001-2010年在本中心进行产前诊断的12841例羊水染色体核型结果,按21三体高风险、18三体高风险、高龄、不良妊娠史、异常家族史、胎儿超声异常、其它等7组产前诊断适应证,对染色体异常核型进行分组分析,根据是否有显著临床意义将染色体异常结果分成高风险染色体异常和低风险染色体异常。分析胎儿染色体异常检出率、主要的高风险染色体异常种类。结果： 12841例羊水中检出染色体异常核型462例(3.60%),高、低风险染色体异常的检出率分别为1,67%和1.92%。不同的适应证中检出的高风险染色体异常比例不同,“胎儿超声异常”指证的高风险染色体异常检出率最高,达27.27%。在所有适应证中,检出的21三体、1.8三体、13三体(T21/18/13)占所有高风险染色体异常的72.56%,检出的21、18、13、X、Y等五种染色体数目异常(21/18/13/X/Y组合)占所有高风险染色体异常的94.88%。在21三体高风险、18三体高风险、高龄和胎儿超声异常等常见产前诊断适应证中,T21/18/13组合分别占高风险染色体异常的78.13%、92.59%、66.07%和54.17%；21/18/13/X/Y组合分别占高风险染色体异常的95.83%、96.30%、94.64%和95.83%。结论： 21/18/13/X/Y组合约占胎儿高风险染色体异常的95%,是产前诊断的主要对象；不同适应证检出的高风险染色体异常有差异,临床应根据具体适应证选择适宜的诊断技术。内容2中国多中心2001-2010高龄孕妇羊水染色体的核型分布研究研究目的：了解高龄指证的变化趋势以及高龄孕妇羊水染色体异常分布情况研究方法：研究数据来源于全国13家产前诊断中心,涉及病例为2001年1月至2010年12月期间在各中心因单一高龄因素就诊的孕妇46258例,按孕妇预产期年龄将高龄孕妇分为35岁组、36岁组、37岁组、38岁组、39岁组、40岁及以上组等7组,对高风险染色体异常进行分组分析。结果：从2001年到2010年,“高龄”占所有产前诊断适应证的比例已从20%上升到46%；在46258例高龄孕妇羊水染色体中检出708例高风险染色体异常(1.53%),其中,21三体、18三体、13三体(T21/18/13)占所有高风险染色体异常的73.59%,21、18、13、X、Y等五种染色体数目异常(21/18/13/X/Y组合)占所有高风险染色体异常的93.93%,罕见染色体异常(包括染色体部分缺失或增加、不平衡易位等)占高风险染色体异常的6.07%。T21/18/13组合和21/18/13/X/Y组合在35、36、37、38组的检出率无显著差异((P=0.133),自39岁组开始有显著增高(P0.001),在39及以上组中,T21/18/13、21/18/13/X/Y组合的检出率分别占该组高风险染色体异常的77.35%和96.86%；罕见染色体异常检出率与年龄关系不显著,在高风险染色体异常中的比例随年龄增加而降低。结论：高龄妊娠产前诊断需求在持续上升,染色体核型诊断压力加大；21/18/13/X/Y组合是该指证产前诊断的主要对象,占所有高龄孕妇中胎儿高风险染色体异常的93.93%,其检出率在39岁后随年龄增加而显著增高。上述数据为选择适宜产前诊断技术提供了依据。第二部分中国汉族人群STR群体遗传学研究与高通量STR检测技术建立研究目的：从大样本人群中获取中国汉族人群STR的群体遗传学数据；建立高通量STR检测技术。研究对象与研究样本：研究对象是21号、18号、13号和性染色体上的44个候选STR基因座以及TAF9b、性别基因Amelogenin (AMEL)、SRY;研究样本包括500例以上中国汉族非亲缘关系个体的全血样本；高风险孕妇羊水样本558例；42例绒毛样本。研究方法： 1)高通量STR检测技术建立的准备工作：采用PRIMER3对所有44个候选STR与基因TAF9b、AMEL、SRY进行引物设计；采用5'ROX、5'TAMRA、5'HEX、6'FAM等荧光标记优选的引物；优化STR-PCR扩增体系的组分；采用Chelex方法提取样本DNA；将所有基因座分别纳入D21、1318XY和1318XYplus等3个STR-PCR体系,对500例以上中国汉族非亲缘关系个体的样本DNA进行扩增,在ABI3130毛细管电泳仪上进行扩增产物检测,分析STR检测情况以及基因型,初步建立41个STR的群体遗传学数据。 2)建立D21高通量STR检测体系(D21体系)与STR群体遗传学数据：挑选21号染色体上11个STR(D21S1432、D21S11、D21S1246、D21S1412、D21S1437、 D21S1413、D21S2039、D21S1270、D21S1435、D21S1446、D21S1409)与Amel基因组成D21体系,建立常见等位基因的标准品(Allelic Ladder),编制D21体系等位基因分型软件,基于500例以上样本基因型检测和等位基因序列分析,建立中国汉族人群21号染色体上11个STR的群体遗传学数据；用D21体系检测558例羊水样本以及42例绒毛样本,确定21号染色体数目诊断标准,以染色体核型为对照,验证D21体系对21三体的诊断符合度。 3)建立D1318XY高通量STR检测体系(D1318XY体系)：挑选13号、18号、X、Y染色体上的19个STR (D18S535、D13S797、DXS1187、DXYS267、 D13S305、DXS6803、D13S628、DXS981、XHPRT、D18S386、D13S634、D18S390、 D18S1002、D13S258、DXS6809、D13S742、D18S391、X22、D18S499)与TAF9b、 Amel、SRY组成检测22个基因座的D1318XY体系,建立常见Allelic Ladder,编制D1318XY体系等位基因分型软件,用D1318XY体系检测558例羊水样本以及42例绒毛样本,以染色体核型为对照,确定13号、18号和性染色体X、Y等4种染色体数目的诊断标准,验证D1318XY体系对上述4种染色体数目异常的诊断符合度。结果：建立了能同时检测12个基因座的D21体系和22个基因座的D1318XY体系,在558例羊水样本和42例绒毛样本中检测出了所有的目标染色体数目异常：21三体、18三体、13三体、性染色体数目异常等。建立了中国汉族人群21号染色体上11个STR的群体遗传学数据。基于500例以上非亲缘关系个体样本的检测,从30个STR(D21体系和D1318XY体系)中发现D21S1412、D21S1270、D21S11、 D21S1442、D18S535、D18S386、D18S1002、D18S499、D18S977、D21S305.D21S634. D13S258、D13S74213、DXS1187、DXS6809、DXS6807、DXYS267、X22、DXYS218等基因座具有相对较高的杂合度,可优选用于QF-PCR技术研究。结论：成功建立了两个高通量STR检测体系(D21体系和D1318XY体系),为后续的QF-PCR研究提供了技术支撑；建立了中国汉族人群在21号、18号、13号和性染色体上41个STR的群体遗传学数据,为挑选QF-PCR适宜STR基因座提供了依据。第三部分中国人群QF-PCR检测技术的建立研究目的：建立中国汉族人群QF-PCR检测技术研究样本：羊水558例(有胎儿染色体核型分析结果)；15例绒毛样本(有FISH结果)；部分胚胎或胎儿的生物学父母的全血；少量血斑、带毛囊毛发、唾液斑、肌肉组织等标本。研究方法：挑选21号、18号、13号和性染色体上的21个STR (D21S1432、D21S1270、 D21S11、D21S1412、D21S1442、D21S1435、D18S535、D18S386、D18S1002、 D18S977、D18S499、D13S305、D13S634、D13S258、D13S742、DXS1187、DXYS218、 DXYS267、DXS981、DXS6809、X22)与AMEL、SRY共23个基因座重新建立高通量STR检测体系(即QF-PCR):设计各基因座排布；采用PRIMER3对所有21个STR与基因AMEL、SRY重新设计引物；采用5'ROX、5'TAMRA、5'HEX、6'FAM等荧光标记优选的引物；优化STR-PCR扩增体系的组分；建立常见等位基因的标准品(Allelic Ladder),编制等位基因分型软件；采用梯度DNA标准品9947A检测QF-PCR的灵敏度；采用不同比例混合的DNA标准品(已知基因型)9947A和9948检测QF-PCR对混合样本基因型的识别能力；用QF-PCR检测血液、血斑、羊水、组织等不同标本类型；评估QF-PCR检测时间与检测通量；以染色体核型或FISH结果为对照,基于558例羊水样本以及15例绒毛样本的检测,验证前期建立的目标染色体数目诊断标准,评估QF-PCR对目标染色体异常的诊断符合度；对部分QF-PCR检测为异常染色体的胚胎或胎儿样本,增加其父源和母源的样本检测,验证多余或缺失染色体的亲缘来源。结果：所建立的QF-PCR技术包含23个基因座,能同时检测21、13、18、X、Y等5种染色体的数目异常；所建立的QF-PCR性能良好：检测灵敏度高、准确、快速、高通量、适用于多种标本类型、可检测出占比20%以上的混合样本的基因型,并可拓展用于异常染色体核型来源的分析。样本检测中发现有灰区和单基因座异常的情况,需要扩大样本研究。结论：本部分研究成功建立了适用于中国人群的QF-PCR技术。第四部分中国人群QF-PCR技术临床应用的前瞻性研究研究目的：了解所建立QF-PCR技术的临床应用“适宜”性。研究方法： 2012年1月-2014年6月期间,收集我院进行羊水产前诊断的剩余羊水925例(不含肉眼可见的新鲜血性羊水),每例2-3ml。检测时取羊水lml,用Chelex方法提取,每批同时检测90个样本,采用建立的QF-PCR体系进行单盲检测,在普通PCR仪上进行扩增,在ABl3130型遗传分析仪上进行毛细管电泳和基因型分析。评估检测成功率、准确性、检测时间与通量、检测可及性等。结果： 925例羊水样本全部检测成功。与核型结果比较,QF-PCR检出了16例目标染色体异常中的15例：21三体8例、18三体3例、13三体1例、45X1例、47XXY1例和47XXX1例。漏诊1例45X嵌合体(核型：46,XX[46]/45,X[4])。QF-PCR与染色体核型对5种染色体异常的检测总一致性为：99.89%(95%CI99.78-100%)；阳性检测一致性为93.75%(95%CI92.95-94.55%)；阴性检测一致性为100%。QF-PCR可批量检测,每例样本平均检测时间16-17min；QF-PCR检测在PCR实验室即可进行。结论：所建立的QF-PCR技术是中国人群“适宜”的产前诊断技术,临床应用中具有快速、准确、高通量、应用方便、价格低廉、质控方便等优越性,有很好的应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.5

【参考文献】