基因单核苷酸多态性（SNP）与卵巢癌多药耐药关系的研究

发布时间：2018-10-16 19:13

【摘要】：卵巢上皮癌治疗方法主要是减瘤术和术后以铂类为主的联合化疗。晚期患者大部分对化疗敏感，但最终常常发展为耐药甚至多药耐药，从而导致治疗失败和患者死亡。临床研究证实的影响患者化疗疗效的主要因素包括卵巢上皮癌病理类型、术后残余灶大小、细胞分化程度及FIGO分期等。但是根据这些临床因素制定的方案而接受治疗的卵巢癌患者自90年代以来其5年生存率始终徘徊不前。分子水平研究证实卵巢癌是一种异质性疾病。目前认为卵巢癌多药耐药机制包括药物外排增加、代谢解毒增强、DNA损伤修复异常等经典途径和基因二次突变、细胞微环境改变等非经典机制，涉及多药耐药相关基因家族、细胞色素p450系统等多个基因以及基因变异、表达异常和调控异常等多层次改变。根据这些差异基因谱、蛋白表达谱等用来诊断预测患者对化疗药物反应性已在某些研究中获得一定程度的成功，但在临床推广使用尚需进一步完善。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）占人群基因组DNA变异的90%以上。已有研究证实SNP与个体药物反应差异性相关。在卵巢癌多药耐药研究方面业已证明多个基因SNP与之相关，但是大部分实验结果相互矛盾，很多阳性位点也未能得到重复验证，样本以及检测位点过少是其主要原因。针对这种情况，有学者提出建立卵巢癌合作组织以增大样本量以及同时检测多个如通路中基因或整个基因组的SNP位点来弥补其不足。目前基因组SNP芯片因其高通量、快速以及相对较低的费效比在大样本筛选癌症新的敏感位点方面获得了令人瞩目的成就，在较低样本筛查药物反应和毒性相关位点方面也取得了不错的成绩。高通量芯片产生的海量数据需要借助于生物信息学来帮助分析。首先在数据处理和统计计算方面，一方面需要分析的数据量和运算速度已大大超过了一般软件如SPSS和SAS等的要求。另一方面不同角度的分析方法对结果有着较大的影响。近来随着生物信息学发展产生了众多帮助全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）软件和方法，针对本研究特点选择有效的软件和分析方法十分重要。其次需要借助生物信息学工具筛选功能性SNP位点。这些位点能够通过异常剪切、编码非同义氨基酸等方式影响基因功能，是后续验证研究的主要来源。最后可以借助生物信息学工具对其他类似高通量数据进行关联或荟萃分析（meta analysis）以补充验证本实验芯片筛选结果。目的本研究拟使用高通量SNP芯片检测多组卵巢组织基因组DNA的SNP位点并采用基因通路富集分析方法筛选出与卵巢癌多药耐药相关的差异生物学通路及其所包括的功能性SNP位点。方法卵巢正常组织、良性腺瘤、敏感癌组织和耐药癌组织共分4组，每组各50例。样本提取的基因组DNA经浓度检测和琼脂糖电泳分析合格后按照Illumina公司建议流程采用The Human OmniZhongHua-8SNP芯片检测。原始探针信号经GenomeStudio软件转换为基因型数据并用PLINK软件进行预处理及质控。等位基因关联检验（allelic test）来获得正常组vs良性组、正常组vs恶性组（敏感组和耐药组之和，下同）、良性vs恶性组以及敏感组vs耐药组比较之后有统计学差异的SNP位点（p0.05）。敏感与耐药组差异SNP在剔除前三组相同SNP后，剩余SNP连同其p值一起输入WebGestalt网站进行基因富集通路分析（gene-set enrichment analysis,GSEA），以BH校正p0.05为标准进行筛选。WebGestalt转换的基因再输入DAVID进行通路分析，以FDR0.05为标准进行筛选。上述两种方法的共同通路在丢弃与耐药无关的通路后保留了12个可能与卵巢癌多药耐药相关的生物学通路。随后应用SciMiner在线工具检索文献以交叉验证上述多药耐药通路及SNP位点。接着运用SNPFUNC网站预计耐药通路中SNP位点的功能并采用Selectome数据库对各耐药相关基因的正选择进行预测。此外还应用PLINK软件计算SNP之间互作效应并对临床病理因素进行了多因素和分层分析。最后应用ROC曲线试图建立预测多药耐药的SNP诊断模型。结果黏着斑信号途径等12个通路与卵巢癌多药耐药相关，包括EFGR基因rs2293347在内的一批基因含有的SNP位点可通过异常剪切等方式影响基因功能。其中ABC transporters和Focaladhesion两条通路以及MRP1（rs4148356）、TP53（rs1042522）及PDGFC（rs1425486）等3个位点在文献挖掘中得到交叉验证。SNP互作效应分析中发现rs111878422、 rs2274223等11个富集位点在整个多药耐药相关SNP互着关系网络中可能发挥关键作用。在耐药相关基因中FYN在237、291、296及298位碱基存在正选择压力。多个SNP在不同临床病理因素的分层分析中发现与多药耐药相关。此外，虽然未能成功建立预测卵巢癌多药耐药的SNP诊断模型，，但是随着SNP数量的增加，其诊断敏感性有随之上升的趋势。结论通过全基因组SNP芯片检测和通路分析发现了多条通路以及SNP位点与卵巢癌多药耐药相关。在后续验证阶段采用扩大的相同病理因素样本可望增加检验效能，最终有望成功建立预测卵巢上皮癌多药耐药的SNP诊断模型。目的采用基因通路分析方法探索卵巢癌多药耐药通路及功能性SNP位点。方法对来自基因表达综合数据库（GEO）的单核苷酸多态性（SNP）芯片数据(编号：GSE13813)在筛选和质控后采用主成分分析方法校正人群分层，并利用PLINK软件的线性回归计算晚期上皮卵巢癌患者多药耐药及敏感组间所有SNP的差异p值。随后采用第2章叙述的通路分析流程来筛选与耐药相关的通路。结果缝隙连接(Gap junction)、紧密连接(Tight junction)和磷脂肌醇信号通路(Phosphatidylinositol signaling system)与卵巢癌多药耐药相关。功能预计结果显示4个连锁性功能SNP（rs1013986、rs2672734、rs5008332和rs700626）可通过异常剪切等方式改变通路内的基因功能。结论这些通路及其SNP位点可以一并纳入后续分析，如果得到验证，有望用于预测卵巢上皮癌耐药目的通过文献检索荟萃分析切除交叉互补1（excision repair cross-complementationgroup1，ERCC1）基因19007C/T多态性与卵巢癌铂类联合化疗反应之间的关系。方法全面检索pubmed、Embase及万方数据库，按照纳入排除标准筛选出合格的文献7篇，共879例经铂类联合化疗的卵巢癌患者。采用stata11.0软件分析该变异不同基因型与化疗反应的关系。采用漏斗图和Begg、Egger法检验有无发表偏倚。结果亚组分析发现利用血细胞作为基因型检测来源者CT较TT（OR=6.52，95%CI1.74-24.42）化疗敏感性升高。漏斗图和Begg、Egger法（PBegg=0.089; PEgger=0.296）检验亚组之间比较无明显发表偏倚。结论ERCC1的19007C/T基因型可纳入后续验证，有助于确立预测卵巢癌耐药的SNP诊断模型。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】