microRNA在流产及早孕蜕膜组织中的表达及miR-199的功能鉴定

发布时间：2018-10-26 18:27

【摘要】：自然状态(非人为目的)发生的流产称为自然流产。在所有临床确认的妊娠中,自然流产的发生率大约为15%。早期流产是指发生在12周以前的流产,而妊娠12周至不足28周的流产定义为晚期流产。microRNAs (miRNAs)是一种内源性非编码小RNA,以完全或非完全互补的方式与其靶mRNA相结合,通过影响靶基因转录或翻译来调控细胞发育、分化、增殖、凋亡及疾病的发生发展等。研究表明,在正常妊娠胎盘、绒毛和正常子宫内膜中,一些miRNA差异表达,并与相关基因存在一定的靶向作用,提示自然流产的发生可能与miRNA的表达有一定的关系。但以往研究检测的miRNA数量有限,有关miRNA在人自然流产和早孕蜕膜中具体表达丰度报道较少。因此深入研究miRN A在自然流产和早孕蜕膜中的表达和功能,可以为研究自然流产的发病机理提供新的线索。研究目的：1.分析miRNA在自然流产和早孕蜕膜中的表达差异,筛选并验证表达差异显著的1niRNA,进一步预测候选miRNA对应的靶基因：2.检测候选靶基因在流产及早孕蜕膜中的表达及意义；3.体外验证miRNA-199b-5p 和 SGK1在维持妊娠中的靶向关系和作用；4.动物实验评价miRNA-199b-5p在妊娠维持中可能的调控作用,探讨mi] RNA在自然流产中的作用。研究方法：1.运用miRNAs测序技术,筛选在自然流产和早孕蜕膜中的差异表达miRNA,发现流产蜕膜中一系列上调和下调的miRNA。2. microRNA检测和鉴定：选取10 个 miRNA,利用实时荧光定量RT-PCR (Real-time PCR)验证miRNA在流产蜕膜(流产组)及早期妊娠蜕膜(早孕组)中的表达水平。3.结合以往研究中与早期妊娠维持关系密切的基因,利用预测软件对实验中出现明显差异表达的microRNA进行靶基因预测,并在体内检测靶基因的表达。4. microRNA的功能鉴定：在体外水平过表达或敲减1niR-199b-5p,检测靶基因表达变化,制备过表达miR-199b-5p的转基因小鼠模型,利用RT-PCR与免疫印迹(Western blot)技术验证靶基因的表达水平。研究结果：1.测序比较了1921条已知miRNA并发现123条新miRNA,与正常早孕蜕膜相比,流产蜕膜有37个差异表达的miRNA,其中20个miRNA在流产蜕膜组织中表达升高,17个miRNA表达下降。在流产蜕膜三个表达量最高的miRNA 是 miR-let-7a-5p、miR-let-7f-5p和miR-let-7b-5p,分别占全部miRNA的25.63%、21.99%和17.82%。2.选取表达量前10个差异miRNA,应用RT-PCR在流产蜕膜与正常早孕蜕膜中进行验证,其中7个miRNA与测序结果相符：1et-7a-5p、 let-7f-5p、let-7g-5p、let-7e-5p、let-7d-5p 和 miR-98-5p在流产蜕膜中表达下降(P0.05)。miR-199b-5p在流产蜕膜中表达升高(P0.05)。3.用生物信息学方法对差异miRNA进行分析,预测出108787个靶基因。通过靶基因评分以及靶基因功能注释,选择miRNAs可能对应的蜕膜化相关的靶基因进行功能性分析。根据靶基因预测结果,选取血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1(Serum-and-glucocorticoid-regulated kinase-1, SGK-1)、胰岛素样生长因子-Ⅱ受体(Ⅰnsulin growth factor 2 receptor, IGF2R)、基质金属蛋白酶10(Matrix metalloproteinase 10, MMP10)和瘦素受体(Leptin Receptor, LEPR)和作为候选靶基因,利用RT-PCR和免疫组化技术验证其在流产蜕膜和正常早期妊娠蜕膜中的表达。SGK1、 MMP10和LEPR在流产蜕膜表达减低,IGF2R在流产蜕膜表达增加。4.将miR-199b-5p模拟物转染293T和Ishikawa细胞,RT-PCR和Western blot结果显示转染后SGK1 mRN A和蛋白水平降低(P0.05)。在293T和Ishikawa细胞中转染miR-199b-5p抑制剂后SGK1 mRNA和蛋白水平增加(P0.05),在hESC (human endometrial stromal cells)中转染miR-199b-5p'慢病毒抑制载体后同样发现SGK1 mRNA和蛋白表达升高。5.在过表达miR-199b-5p转基因小鼠子宫组织中,SGK1 mRNA和蛋白水平降低(P0.05)。结论1.早孕蜕膜中特异表达的miRNA可能参与了子宫内膜蜕膜化以及早期妊娠的维持。自然流产蜕膜组织中存在一些表达失衡的miRNA,这些异常表达的miRNA可能与自然流产的发生有关。2.通过对差异miRNA的GO和KEGG分析,捕获了大量蜕膜化相关的靶基因,并分析出可能与之相关联的细胞信号通路,有望通过靶基因的研究揭示差异miRNA的调控机制。3.体内外实验结果显示niR-199b-5p与SGK1的表达有反向调控关系,miR-199b-5p有可能通过调控SGK1影响早期妊娠维持。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.21

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本文编号：2296589