Activin A及其相关生长因子在子宫内膜异位症发病及诊治策略中的价值

发布时间：2018-10-31 10:52

【摘要】：研究背景子宫内膜异位症现已成为育龄期女性的常见病、多发病,近年来其发病趋势明显上升,达10%-15%,故又有“现代病”之称。子宫内膜异位症主要引起不孕、痛经、性交痛及慢性盆腔痛等症状,严重影响了妇女健康和生活质量。子宫内膜异位症虽是一种良性疾病,但病变广泛、形态多样,具有种植、侵袭、扩散、远处转移及复发等恶性生物学行为。子宫内膜异位症的发病机制目前仍不明确。1921年Sampson提出经血逆流学说后得到了多数临床和实验资料的支持,但经血逆流至盆腔是常见的,甚至是生理现象,多数人并未罹患子宫内膜异位症。近年来,我国学者提出“在位内膜决定论”,认为在位子宫内膜的生物学特性是子宫内膜异位症发生的决定因素。在卵巢性激素的周期性调控下,子宫内膜产生的细胞因子也发生周期性改变,这其中就包括Activin A及其相关生长因子(Follistatin、Cripto)。正常生理状态下,在卵巢激素的调控下,子宫内膜从增殖期转化到分泌期,Activin A逐步升高,至分泌晚期达到最高水平,Cripto在增殖期增高,而Follistatin则一直处于相对的低水平。最新研究表明,子宫内膜异位症在位子宫内膜Activin A mRNA表达于月经周期无显著性改变,增生期显著高于正常月经周期的子宫内膜,但无分泌期表达高峰；Follistatin mRNA表达在分泌期显著高于增生期及正常月经周期的子宫内膜；Cripto mRNA表达在增生期及分泌期无显著性差异,无分泌期降调。由此我们推断,子宫内膜组织内Activin A及其相关生长因子之间可能存在着某种动态平衡,这种动态平衡决定了Activin信号通路的开放与阻断,从而表达所需要的生理效应。目前已有研究表明Activin A、Follistatin、Cripto之间动态平衡的改变可增强在位内膜细胞的增殖、粘附、侵袭及血管生成能力,并促使其释放加速内异症的发生发展的细胞因子。但是,影响在位子宫内膜Activin A、Follistatin、Cripto表达及分泌的原因目前仍不清。众所周知,内异症是一种性激素依赖性疾病,也是一种炎症性疾病,大量的炎性因子表达异常,白细胞介素-1β即为其中重要分子之一。那么,炎性因子及雌激素是否参与到Actin A及其相关因子的调控中来呢?本课题拟对此进行探讨,观察白细胞介素-1β及雌激素对子宫内膜异位症增生期在位子宫内膜Activin A、Follistatin以及Cripto等因子的影响。从1885年Von Recklinghausen首次提出并命名子宫内膜异位症至今已超过一个世纪,尽管现已初步建立子宫内膜异位症的临床诊疗策略,但目前仍旧面临疼痛与不育,术后或停药后复发率高,深部病灶处理棘手等问题,新的治疗方案一直是人们探索的热点。子宫内膜异位症的分子机理研究为治疗提供了新的对策,如促进分泌期内膜蜕膜化,促进细胞凋亡,抗粘附,抗侵袭,抗血管生成等。子宫内膜异位症在位与异位内膜Activin A mRNA于分泌期表达减少,其拮抗物Follistatin及Cripto mRNA表达增多。由此我们推测这使得Activin A于分泌期作用减弱,内膜丧失蜕膜化机会,提高了异位种植生长的机会；且Cripto可促进细胞增殖、迁移、侵袭、上皮一间质转化和血管形成等。这亦可能促进子宫内膜异位症的发生发展。因此本研究以Cripto中和性封闭单克隆抗体作用于体外培养的子宫内膜异位症分泌期异位内膜间质及上皮细胞,在细胞水平初步探讨Cripto中和性封闭单克隆抗体对子宫内膜异位症的治疗作用。目的本研究拟原代培养子宫内膜异位症增生期在位内膜标本,鉴定证实为子宫内膜间质细胞后,以不同浓度的白细胞介素-1β及雌激素进行干预,采用逆转录实时荧光定量PCR技术及酶联免疫吸附试验,分别从mRNA及蛋白水平检测Activin A、Follistatin、Cripto的变化。同时分离、培养、鉴定卵巢子宫内膜异位囊肿内壁的分泌期子宫内膜间质细胞及上皮细胞,鉴定为间质细胞及上皮细胞后,分别设立Cripto中和性封闭单克隆抗体处理组和空白对照组。以Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡,结晶紫染色法检测细胞粘附,Transwell小室法检测细胞侵袭。探讨白细胞介素1β及雌激素对子宫内膜异位症增生期在位内膜间质细胞Activin A、Follistatin、Cripto表达及蛋白分泌的影响以及Cripto中和性封闭单克隆抗体对子宫内膜异位症分泌期异位内膜细胞的抑制作用。为进一步探索子宫内膜异位症的发病机制提供有价值的科研资料并为子宫内膜异位症的治疗策略提供新的思路和方法,解除患者痛苦,降低复发率,减少癌变,提高生育能力,改善临床治疗效果。方法 1.收取子宫内膜异位症患者增生期在位子宫内膜,采用酶消化的方法分离出人子宫内膜细胞,用200目的滤网过滤后,分离出间质细胞,并用波形蛋白和角蛋白鉴定。 2.取培养至第三代的对数生长期的子宫内膜间质细胞,以不同浓度的白细胞介素-1β (250pg/ml,500pg/ml,750pg/ml)、雌激素(10-7mol/L,10-6mol/L,10-5mol/L)及雌激素+白细胞介素-1β(10-6mol/L雌激素+500pg/ml白细胞介素-1β)进行干预。 3.利用RT-qPCR技术检测干预前后Activin A、Follistatin、Cripto mRNA表达的改变情况。 4.利用酶联免疫吸附试验检测干预前后Activin A、Follistatin、Cripto蛋白分泌水平的改变情况。 5.收取分泌期卵巢子宫内膜异位囊肿内壁标本,采用组织块贴壁法,分离出基质细胞及上皮细胞,用波形蛋白和角蛋白分别对两种细胞进行鉴定。 6.取培养至第三代的对数生长期的间质细胞及培养至第一代的对数生长期上皮细胞,分别设立Cripto单克隆中和抗体处理组(加入Cripto单克隆中和抗体至终浓度为5μg/mL)和空白对照组(仅加入完全培养基)。 7.利用Annexin V-FITC/PI流式细胞术分别检测Cripto单克隆中和抗体处理组和空白对照组细胞凋亡的改变情况。 8.利用结晶紫染色法分别检测Cripto单克隆中和抗体处理组和空白对照组细胞粘附能力的改变。 9.利用Transwell小室法分别检测Cripto单克隆中和抗体处理组和空白对照组细胞侵袭能力改变情况。 10.统计学分析：本实验所有数据计量资料用算术均数±标准差(x±SD)描述,多组间均数比较采用单因素方差分析,Bonferroni检验进行组间比较,检验水准α=0.05。两组间均数比较做方差齐性检验后,采用两独立样本t检验,检验水准均为α=0.05。结果 1.在位内膜间质细胞培养、观察及鉴定在长满整个培养瓶前,细胞彼此分开,形态较扁平,外形轮廓不太清楚,核不明显。当细胞长满细胞培养瓶时,细胞排列紧密,呈细长梭形,呈平行排列。细胞免疫组化鉴定示波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。 2.经白细胞介素-1β及雌激素刺激,Activin A、Cripto的mRNA表达较对照组呈剂量依赖性增加(P0.05)。经白细胞介素1β刺激,Follistatin的mRNA表达较对照组呈剂量依赖性增加(P0.05)；经雌激素刺激,各组Follistatin mRNA表达无统计学差异。经雌激素及白细胞介素-1β共同刺激,Activin A、 Cripto的mRNA表达较对照组、雌激素组及白细胞介素-1β组增加(P0.05)；Follistatin的mRNA表达较对照组及雌激素组增加(P0.05),较白细胞介素-1β组差异无统计学意义。 3.经白细胞介素-1β及雌激素刺激,Activin A蛋白分泌较对照组呈剂量依赖性增加(P0.05)。经白细胞介素-1β刺激,Follistatin蛋白分泌较对照组呈剂量依赖性增加(P0.05)；经雌激素刺激,各组Follistatin蛋白分泌无统计学差异。白细胞介素-1β浓度为500pg/ml时,Cripto含量较对照组增加(P0.05)。雌激素浓度为10-6mol/L及10-5mol/L时,Cripto蛋白分泌较对照组增加(P0.05)。经雌激素及白细胞介素-1β共同刺激,Activin A、Follistatin蛋白分泌较对照组、白细胞介素-1β组及雌激素组增加(P0.05)；Cripto蛋白分泌较对照组增加(P0.05)。 4.异位内膜细胞的培养、观察及鉴定间质细胞在长满整个培养瓶前,分散生长,呈伸展状,外形轮廓不甚清楚,核不明显。长满细胞培养瓶时,细胞排列紧密,细长梭形,呈平行排列。细胞免疫组化鉴定示波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。上皮细胞为致密细胞集落,呈插入性生长,多角形或蝌蚪状,轮廓清晰,核较大且明显,旋涡状或团状排列。细胞免疫组化鉴定示波形蛋白染色阴性,角蛋白染色阳性。 5. Cripto中和性封闭单克隆抗体分别作用于子宫内膜异位症分泌期异位内膜间质细胞、上皮细胞,可见凋亡细胞较对照组增加,差异有统计学意义。 6. Cripto中和性封闭单克隆抗体分别作用于子宫内膜异位症分泌期异位内膜的间质细胞、上皮细胞,可抑制细胞粘附,与对照组相比,差异有统计学意义。 7. Cripto中和性封闭单克隆抗体分别作用于子宫内膜异位症分泌期异位内膜间质细胞、上皮细胞,穿膜细胞数较对照组减少,差异有统计学意义。结论 1.白细胞介素1β及雌激素可影响子宫内膜异位症增生期在位内膜Activin A、Follistatin、Cripto的分泌及表达,提示其可能参与Activin A及相关因子的调控。 2. Cripto中和性封闭单克隆抗体可诱导子宫内膜异位症分泌期异位内膜间质、上皮细胞凋亡,并抑制其粘附、侵袭,提示通过拮抗Cripto蛋白可能可以抑制子宫内膜异位症的发生发展。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R711.71

【参考文献】