硒化合物调控凋亡相关microRNA诱导宫颈癌细胞凋亡

发布时间：2018-11-16 19:46

【摘要】：目的：探讨二氧化硒（SeO2）对宫颈癌细胞凋亡的诱导作用及其表观调控机制，明确硒化合物抗肿瘤作用的机制，为其作为抗癌药物的开发提供实验依据。 方法： 1. 细胞培养与分组：选择不同HPV亚型宫颈癌细胞株Hela细胞、Caski细胞作为实验对象，用含10%FBS的RPMI 1640培养基常规培养细胞，置于含5%CO2的37℃恒温培养箱中培养至对数期，随机分为实验组和空白对照组。实验组予不同浓度SeO2（1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L）处理24h，空白对照组予无血清培养基。根据待测指标需要取样待测。 2.指标检测：倒置光学显微镜下观察不同组两株细胞株经过SeO2处理后的形态学变化；用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测SeO2对细胞增殖及活力的影响；利用流式细胞术检测各组细胞凋亡率；用Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3、P53蛋白表达的水平；Step-loop实时定量PCR检测细胞内凋亡相关microRNA(miRNA) let-7a的表达水平。 结果： 1. 形态学观察：倒置光学显微镜下可见，SeO2对体外培养的宫颈癌细胞株生长形态均产生明显影响。与对照组细胞相比，细胞变圆皱缩，胞内颗粒增多，失去正常形态，，贴壁细胞减少，增殖减慢；随着SeO2作用浓度的提高，细胞密度逐渐降低，细胞间间隙逐步增大，呈剂量依赖性。 2.细胞增殖活力分析：采用MTT法检测SeO2对不同宫颈癌细胞株抑制作用，结果示SeO2对宫颈癌细胞株的抑制作用呈量效依赖关系，Hela细胞各实验组（1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L）细胞抑制率分别为1.22%、20.25%、35.03%、43.56%、60.74%，其中7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L浓度组与对照组差异显著（P＜0.05）；SeO2对Caski细胞的抑制作用随药物浓度的升高亦呈明显上升趋势，各实验组（1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L）细胞抑制率分别为14.39%、34.08%、43.01%、57.73%、68.65%，与对照组相比均有统计学差异（P＜0.05）。 3.凋亡检测：运用流式细胞术检测不同浓度SeO2对宫颈癌细胞株的凋亡诱导作用。随着SeO2药物浓度的升高，诱导作用逐渐增强，呈浓度依赖性。0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L浓度SeO2诱导Hela细胞凋亡率分别为3.12%、30.56%、33.42%、37.50%、45.43%、69.38%，0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L浓度SeO2诱导Caski细胞凋亡率分别为3.7%、10.7%、67.5%、78.2%、87.1%、85.2%，凋亡率均随药物浓度增加呈上升趋势。 4. Caspase-3、P53蛋白表达水平测定：采用Western blot技术分析不同细胞组凋亡相关蛋白表达水平，结果显示SeO2可明显上调宫颈癌细胞株中Caspase-3与P53蛋白水平。对Hela细胞的Caspase-3、P53蛋白表达上调作用于7.5μmol/L处达到峰值，各实验组较空白组均有显著差异（P＜0.05）。Caski细胞中低浓度组Caspase-3蛋白诱导作用不明显，至7.5μmol/L、15μmol/L及30μmol/L浓度蛋白表达量较空白组有显著差异（P＜0.05）。各实验组对P53蛋白水平的诱导作用较空白组均有显著差异（P＜0.05）。 5. Let-7a表达水平分析：Step-loop实时定量PCR检测不同组宫颈癌细胞株凋亡相关miRNA let-7a表达，结果表明实验组细胞let-7a表达水平显著提高，在7.5μmol/L处出现峰值，－"

本文编号：2336472