TRP14调控自噬诱导卵巢癌细胞紫杉醇耐药的体内外研究

发布时间：2018-12-11 13:39

【摘要】：卵巢癌仍然是迄今致死率最高的妇科恶性肿瘤,根据美国国家健康统计中心2014年公布的数据,美国卵巢癌总的5年生存率为44%,其中晚期病例仅为27%。自从上世纪90年代紫杉醇成为最主要的一线化疗药物以来,晚期卵巢癌的近期缓解率已达到80%以上,但大多数患者在2-3年内复发,几乎所有复发性卵巢癌对再次化疗耐药,化疗耐药是卵巢癌患者治疗失败和死亡的最主要原因之一克服紫杉醇耐药,已成为提高卵巢癌远期生存率的关键。紫杉醇是一种促微管聚合和稳定,抗有丝分裂的细胞周期特异性药物。研究表明,与紫杉醇耐药相关的机制主要包括：P-糖蛋白等药物泵蛋白表达增加；微管动态变化异常和βⅢ微管蛋白同型分子的异常高表达；微管相关和细胞骨架调节相关蛋白阻碍紫杉醇和微管结合；促凋亡和抗凋亡相关蛋白表达异常或磷酸化活性异常等。但根据已有报道,各种针对这些靶点的阻遏方法仅能部分逆转卵巢癌耐药,事实上迄今尚没有一种基于上述机制建立的逆转耐药的方法应用于临床。卵巢癌耐药的关键机制尚有待阐明。近期研究表明紫杉醇耐药还与自噬(Autophagy)相关。自噬属于程序性细胞死亡,发现于上世纪60年代早期。自噬现象广范存在于多细胞生物体内,参与细胞的正常生长发育过程和维持代谢平衡。近年发现,自噬与肿瘤密切相关。根据细胞质内物质与溶酶体融合的途径不同,自噬可以分为分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬。巨自噬,也即通常所说的自噬,其主要特点是细胞浆内的双层膜结构,包裹部分长周期蛋白质和受损的细胞器,形成自噬小泡,自噬小泡进一步与溶酶体融合形成自噬-溶酶体,其包裹的内容物经过溶酶体水解酶的降解,又再次释放到细胞质中。这一过程受到精密调控,自上而下涉及Atgl/Atg13/Atg17复合物、Vps34/Beclinl/Atg14复合物、Atg5/Atgl2/Atg16复合物和LC3等,其中Beclinl是最重要的自噬调控分子之一,处于自噬调控的关键位置。目前认为,依赖于细胞的不同状态和细胞所受刺激的不同,自噬既可以引起细胞程序化死亡,也可以促进细胞存活。当细胞微环境发生改变,不利于细胞生长时(如营养受限或者药物作用),细胞可通过自噬过程的分解代谢提供营养物质或清除受损的蛋白和细胞器,维持细胞生存；而持续的自噬又可导致细胞自噬性死亡。近年发现,自噬既是化疗药物作用后肿瘤细胞死亡的形式之一,更重要的,它也是肿瘤细胞耐受化疗药物作用的机制之一。因此,阐明自噬的调控机制及其在卵巢癌紫杉醇耐药中的作用,将为卵巢癌的药物治疗开辟崭新的领域。本课题组在前期研究中,对卵巢癌紫杉醇耐药细胞SKOV3-TR30和亲代SKOV3细胞采用液相色谱-质谱联合的定量蛋白质组学技术进行筛选,进一步通过qRT-PCR和Western Blot验证,我们发现硫氧还蛋白相关蛋白14(TRP14)在紫杉醇耐药细胞株中表达显著升高。TRP14是一种新发现的二硫还原酶。人源TRP14蛋白由123个氨基酸残基组成,相对分子质量为14KD,与含有105个氨基酸残基的硫氧还蛋白1(Trx1)具有20%的序列一致性和37%的相似性,含有保守的CPDC模序,活性半胱氨酸残基分别为Cys43和Cys46,因此属于Trx蛋白家族。目前对TRP14的功能了解甚少,仅有的报道提示TRP14参与肿瘤坏死因子(TNF-α)信号途径的调控。目前已经明确在多种细胞中,INF-α信号途径均能诱导细胞自噬。因此前期的研究基础和相关文献提示,卵巢癌细胞中TRP14高表达可能与紫杉醇耐药和自噬相关。本研究首先通过Western Blot、GPF-LC3质粒转染和透射电镜技术发现紫杉醇可促进卵巢癌细胞自噬小泡生成,增强自噬流,并同步上调TRP14表达；采用siRNA干扰Beclinl可抑制卵巢癌细胞自噬,并增加卵巢癌细胞紫杉醇敏感性。进一步采用siRNA干扰和质粒转染调控TRP14表达可同步改变Beclinl表达和细胞自噬水平,进而影响卵巢癌细胞紫杉醇敏感性。通过免疫组织化学检测发现,在卵巢癌组织中均有TRP14和Beclinl表达,且TRP14和Beclinl高表达与卵巢癌病人化疗耐药,高危临床病理参数和更差的预后相关。TRP14通过Beclinl的参与调控细胞自噬水平,进而诱导卵巢癌细胞紫杉醇耐药。TRP14和Beclinl表达可作为预测卵巢癌病人化疗反应和预后的指标。第一部分紫杉醇激活的自噬诱导卵巢癌细胞对紫杉醇耐药目的：观察紫杉醇作用于卵巢癌细胞后,自噬小泡生成和自噬流的改变；明确紫杉醇诱导的自噬水平改变对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的调控作用。方法：以不同浓度紫杉醇作用于卵巢癌细胞一定时间后,采用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3B, Atg5和Beclinl的表达,以共聚焦荧光显微镜观察转染GFP-LC3质粒后GFP-LC3-Ⅱ阳性小泡数量,透射电镜观察自噬小泡超微结构,综合评价紫杉醇对卵巢癌细胞自噬小泡的诱导作用。同时以溶酶体抑制剂BafA1抑制溶酶体降解过程,采用Western Blot检测LC3B-Ⅱ和p62蛋白表达变化,观察紫杉醇作用于卵巢癌细胞后自噬流的改变。进一步干扰自噬调控基因Beclinl抑制自噬,观察自噬对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响。结果： 1.紫杉醇诱导A2780,3A0, SKOV3细胞自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ, Atg5和Beclinl表达显著增加 2.10nM紫杉醇作用于A2780,3A0, SKOV3细胞24h后,共聚焦免疫荧光发现GFP-LC3B-Ⅱ阳性小泡数量显著增加,在透视电镜下观察到更多自噬小泡或自噬-溶酶体融合泡。 3.利用BafAl抑制溶酶体降解后,在紫杉醇作用组导致的LC3B-Ⅱ和p62表达增加更加显著。 4. siRNA干扰Beclinl表达可抑制A2780和3AO细胞自噬水平,并增加细胞对紫杉醇的敏感性。结论： 1.紫杉醇可促进卵巢癌细胞自噬小泡形成、增强自噬流。 2.紫杉醇激活的自噬诱导了卵巢癌细胞对紫杉醇耐药。第二部分TRP14通过Beclinl调控自噬并诱导卵巢癌细胞对紫杉醇耐药目的：证明TRP14通过自噬调控蛋白Beclinl的参与,调控卵巢癌细胞自噬,进而影响卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。方法：首先观察紫杉醇对卵巢癌细胞TRP14表达的影响；再以siRNA干扰TRP14表达,以pcDNA3.1(+)-TRP14质粒高表达TRP14,观察卵巢癌细胞在紫杉醇作用时和饥饿状态下Beclinl表达和自噬水平改变；及其卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的变化。结果： 1.紫杉醇可诱导A2780,3A0, SKOV3细胞TRP14表达增加。 2.以siRNA下调A2780和3AO细胞TRP14表达,可同步下调Beclinl, LC3B-Ⅱ, Atg5的表达；相反以pcDNA3.1(+)-TRP14上调TRP14表达,则可同步上调Beclinl, LC3B-Ⅱ, Atg5的表达,且Beclinl干扰可再次抑制LC3B-Ⅱ, Atg5表达。 3.以siRNA下调TRP14表达,可增加A2780和3AO细胞紫杉醇敏感性；相反以pcDNA3.1(+)-TRP14上调TRP14表达,则可降低细胞紫杉醇敏感性,且Beclin1干扰后,紫杉醇敏感性再次增加。结论： 1.TRP14是卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的重要调控分子。 2.TRP14通过调控Beclin1表达改变卵巢癌细胞的自噬水平,进而影响其对紫杉醇的敏感性。第三部分TRP14和Beclinl在卵巢癌组织中的表达和临床意义目的：观察TRP14和Beclinl在卵巢癌组织中的表达和临床意义。方法：利用免疫组织化学的方法检测TRP14和自噬调控蛋白Beclinl在157例卵巢癌组织中的表达,并分析与卵巢癌病人年龄、FIGO分期、肿瘤分级、腹水量、术前血清CA125水平、初次手术满意度、化疗敏感性等临床病理参数的相关性,及其对无瘤生存时间(PFS)和总生存时间(OS)的影响。结果： 1.TRP14高表达与化疗耐药、更高的血清CA125水平和不满意的肿瘤细胞减灭术显著相关。TRP14高表达的卵巢癌病人表现为更短的PFS和OS。 2. Beclinl高表达与化疗耐药、更高级别的FIGO分期,更高的血清CA125水平和不满意的肿瘤细胞减灭术显著相关。Beclinl高表达的卵巢癌病人表现为更短的PFS和OS。 3.TRP14高表达和Beclinl高表达显著相关。结论： 1.TRP14和Beclinl在卵巢癌组织中的表达存在显著相关性,其高表达均与卵巢癌耐药、高危临床病理参数和不良预后显著相关。 2.卵巢癌组织TRP14和Beclinl表达可作为预测卵巢癌化疗反应和预后的指标。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【共引文献】