Oligo microarray在PGS中的应用及小鼠卵母细胞非整倍体形成的作用机制

发布时间：2018-12-26 08:39

【摘要】：研究背景辅助生殖技术(ART)已经成为治疗人类不孕不育的一个重要手段和途径。临床研究发现，染色体异常胚胎（非整倍体胚胎）的比例高（50-70%），而非整倍体胚胎植入是导致生殖助孕后妊娠率和着床率较低的原因之一，同时也是导致出生缺陷发生的原因。很多报道指出，在高龄、反复植入失败、复发性流产、非整倍体妊娠妇女中胚胎非整倍体发生率非常高。植入前遗传学筛查（Preimplantationgenetic screening, PGS）技术，通过体外受精（In-vitro fertilization, IVF）获得卵母细胞或胚胎，经活检遗传学分析，选择正常胚胎移植，可避免遗传病妊娠发生，将产前遗传学诊断提前到胚胎植入之前。当前，利用PGS技术可以诊断40多种包括常染色体显性、隐性及X性连锁遗传的变异，该技术具有重大的优生学意义，也是诊断植入前胚胎非整倍性和其他染色体异常的一种重要手段。随着PGS技术的迅速发展，其在PGS中的应用必将越来越广泛，未来将有更多新技术应用于临床，能有效筛选染色体异常的胚胎，提高辅助生殖技术成功率。研究目的把Oligo DNA芯片应用于人类胚胎植入前遗传学筛查，评估该芯片在PGS中应用价值，希望用这种新的芯片技术确定胚胎中微小的染色体异常，从而筛选PGS中染色体正常的胚胎进行移植，提高胚胎着床率和临床妊娠率。研究方法在本研究中，我们对进行体外受精（IVF）的病人第5/6天的囊胚进行活检，并进行Oligo DNA芯片检测，结果异常的囊胚进行FISH检查进一步确定Oligo DNA芯片的准确性。Oligo DNA芯片筛选后正常囊胚进行FET，并进行数据统计分析。研究结果 1、寡核苷酸基因芯片可检测到更小的染色体异常片段 630K寡核苷酸基因芯片最小可检测小至1.3mb大小的异常片段， Oligo基因芯片平台比BAC平台灵敏度更高。 2.植入前胚胎中非整倍体、部分染色体缺失或重复发生率较高全部样本进行基因检测后发现41.9%为正常整倍体囊胚，58.1%为异常囊胚，219个异常囊胚中，94个（42.9%）为单条染色体发生错误，101个（46.1%）为多条染色体发生错误，15个（6.9%）为正常整倍体但某些染色体部分缺失，7个（3.2%）为正常整倍体但某些染色体部分重复，2个（0.9%）为正常整倍体但某些染色体同时部分缺失和重复。 3、移植正常整倍体囊胚可获得较高的妊娠率和胚胎着床率。 31个病人进行了34次FET，结果临床妊娠率为58.8%，胚胎着床率为54.4%。而我们的研究中没有发现高龄妇女组与反复性流产妇女组之间在临床妊娠率和胚胎着床率方面有明显差异。 4、Oligo基因芯片准确性评估我们用10个已知染色体异常的囊胚进一步进行FISH检测，所有样本进行FISH后结果均与Oligo基因芯片检测结果相符。研究结论 1、在高龄患者和/或反复流产患者植入前囊胚中非整倍体发生率较高，在高龄患者中非整倍体发生率更高。 2、Oligo基因芯片检测可用于检测囊胚活检细胞的大部分染色体异常，如非整倍体、部分染色体缺失和/或重复。 3、移植芯片检测筛查后的囊胚能明显提高临床妊娠率和胚胎着床率。 4、Oligo基因芯片将来可在IVF-PGS过程中可作为常规手段在更多临床患者中使用。研究背景辅助生殖技术解决了包括排卵困难、内分泌异常，少、弱精子症等患者受孕困难的问题，然而，大量研究均表明，高龄妇女进行辅助受孕后妊娠结局明显低于育龄妇女，其关键问题在于高龄妇女的卵子出现了不可逆转的老化现象。就目前而言，随着女性生育年龄不断推迟，导致卵子老化的问题日益严重，同时也为辅助生殖技术提出更高要求。有研究表明，衰老卵子其染色体出现非整倍体异常的概率比年轻卵子高。虽然年轻妇女染色体异常低于高龄妇女，但今年来有上升的趋势，环境因素可能是引起卵子提早衰老的主要原因之一。衰老卵子与卵子非整倍体的形成之间关系一直没有得到解决，而造成卵子染色体异常的原因和卵子内的超微细胞器变化的机理仍然不太清楚。研究目的从细胞水平上了解体外成熟培养的卵子其超微结构变化与非整倍体发生及卵子受精发育潜能的关系，并通过添加重金属耦合剂和抗氧化剂观察是否能降低卵子内氧化应激水平，从而保护卵子免受氧化应激损伤，提高卵子受精发育能力，在防止卵子老化和为高龄妇女提供辅助生殖策略等方面均有重要的意义。研究方法 1、C57BL/6J小鼠GV期卵母细胞体外成熟培养。 1.1GV期卵母细胞分别置于4个不同体外成熟培养体系中培养。A组为添加重金属耦合剂的IVM培养体系；B组为添加抗氧化剂的IVM培养体系；C组为同时添加重金属耦合和抗氧化剂的IVM培养体系；D组为普通IVM培养体系。 1.24个体外成熟培养体系的卵母细胞分别培养12-14小时、24-26小时、46-48小时。 2、卵母细胞染色体检查。采用免疫荧光细胞化学法进行染色体检查。 3、卵母细胞线粒体膜电位检测。采用免疫荧光标记JC-1法进行细胞线粒体检查。 4、卵母细胞内ATP含量检测。采用化学发光法进行细胞ATP含量检查。 5、卵母细胞纺锤体检查。采用免疫荧光细胞化学法进行纺锤体检查。 6、卵母细胞受精发育能力检查。对成熟卵母细胞进行IVF，计算2细胞形成率。研究结果 1、卵子体外成熟过程中非整倍体发生率较高，并随着时间增长而增高，，而添加重金属耦合剂和抗氧化剂对防止非整倍体形成没有明显影响。 2、重金属耦合剂和抗氧化剂影响IVM体外衰老卵子的线粒体活性，提高衰老卵子线粒体活性。 3、体外成熟衰老过程中纺锤体异常率随时间变化逐渐增高，重金属耦合剂和抗氧化剂在可能早期体外培养过程中能防止异常纺锤体形成。 4、卵子内ATP浓度随老化时间增长而降低，重金属耦合剂和抗氧化剂不能明显提高卵子细胞内ATP含量。 5、重金属耦合剂组和抗氧化剂未能明显提高MII期卵子成熟率，但能提高IVF受精率。研究结论 1、体外成熟的GV卵子非整倍体发生率较高，培养时间越长非整倍体发生率越高，而在培养液中加入重金属耦合剂和抗氧化剂培养未能降低其非整倍体发生率。 2、衰老卵子超微结构发生明显改变，重金属耦合剂和抗氧化剂可提高线粒体活性，减低异常纺锤体形成，而对卵子内ATP含量没有直接影响。 3、随着体外成熟时间延长，卵子体外衰老过程中卵子受精能力明显降低，而加入重金属耦合剂和抗氧化剂后能延缓卵子衰老时间，增强其受精能力。
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【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.8

【参考文献】