WDHD1在HPV E7诱发的宫颈癌及其他肿瘤细胞中的功能及调节机制

发布时间：2019-01-08 08:47

【摘要】：人乳头瘤病毒HPV (human papillomaviruses)感染是导致宫颈癌发生的首要危险因素。根据人乳头瘤HPV病毒对生殖系统的致癌危险性将其划分为“高危型”和低危型”,高危型HPV病毒有HPV 16、18、31、33、51等十余型,常常引起细胞恶性转化。HPV 16亚型主要引发鳞癌,HPV18亚型主要引发腺癌。我国患宫颈癌的比率是15/10万/年,仅次于发病第一的国家-智利。目前我国宫颈癌的死亡率是11.34%,居女性癌症死亡率第二位,特别是在西部地区,宫颈癌死亡率位于女性癌症死亡率之首,因此我国将宫颈癌列为癌症防治重点之一。流行病学调查结果显示高危型人乳头瘤病毒的持续感染是导致宫颈癌发生发展的首要启动因子。目前虽然预防性的HPV疫苗已经研究成功并上市(包括二价疫苗,四价疫苗,九价疫苗),但这些疫苗最多只能预防9种HPV亚型的感染,并不能涵盖所有HPV的高危亚型,而且对已经感染HPV病毒或者患有免疫缺陷抑制疾病的病人无效。由于目前并未阐明高危型HPV病毒的致病机理,因此临床尚未研究出针对HPV病毒的特异性药物。HPV病毒属于小环状病毒,高危型HPV病毒主要是借助E6和E7蛋白来发挥其致癌性,E6和E7蛋白分别与肿瘤抑制基因p53和pRb结合并导致其失活,引起宫颈组织细胞的生长失控和恶性转化,从而诱导宫颈组织癌变。但是我们对E7蛋白的了解仍不充分,比如E7如何诱导细胞越过G1检验期进入S期,一直不十分清楚。细胞周期能够有条不紊地进行,主要在于细胞内存在监控机制即细胞周期检验点(cell cycle checkpoints)。细胞周期检验点一旦发生异常,就会导致基因组发生不稳定,目前基因组不稳定已被认定为癌症进展的一个重要标志。多倍体(即细胞拥有两套以上的染色体)作为基因组不稳定的表现形式之一,已被公认为肿瘤发生的重要诱因。有意义的是,在宫颈癌的发生早期可以检测到多倍体细胞的存在。多倍体的形成原因之一为DNA重复复制(re-replication),即在一个细胞周期内复制启动一次以上或者多次连续的S期复制却没有进行有丝分裂。我们最近研究发现,HPV-16 E7能够诱导细胞发生重复复制,高危型HPV-16 E7可以通过上调DNA复制因子Cdt1诱导原代角质化上皮细胞(PHKs)在G2期进行重复复制,从而导致多倍体细胞的形成。除此之外,我们对E7如何诱导DNA重复复制知之甚少。正常细胞里的基因组DNA在每一轮细胞周期内只会复制一次。复制起始分为两步：复制前复合体(pre-RC)的组装和激活。复制前复合体的组装过程受到细胞周期的调控,该过程主要发生在有丝分裂的晚期以及G1期。MCM2-7在DNA复制起始及延长(通过解开DNA双螺旋)中均发挥重要作用。在真核细胞复制开始后,这些起始蛋白会被降解或被抑制从而使细胞不能发生重复复制。细胞通过采用一些检验许可点来监测是否有足够的复制起始因子来启动复制从而防止细胞提前进入S期。G1检验点之所以能够决定细胞能否进入S期进而开始DNA复制,主要是因为在G1早期Cdk4-Cdk6对pRb的部分磷酸化及在G1晚期Cdk2对pRb的完全磷酸化的调控。我们的前期研究结果显示表达高危型HPV E7的细胞在DNA损伤及血清饥饿条件下可以逃避G1检验点的监控,这些结果与有关文献报道一致。但是对于E7如何调控细胞周期G1检验点的机制目前尚不十分清楚。第一部分WDHD1在人乳头瘤病毒HPV E7诱发的肿瘤形成中的作用用一种永生化的角质化细胞Spontaneously immortalized human foreskin keratinocytes (NIKS),我们利用RNA-seq技术将E7表达细胞与对照细胞全基因组范围内的转录组进行了测序与分析。共发现有237个基因在E7表达细胞与对照细胞之间存在明显表达差异,其中150个基因在E7表达细胞中表达上调,87个基因在E7表达细胞中表达下调。为了验证RNA-seq数据的可靠性,我们基于E7相关的生物学功能选择了12个基因分别在NIKS(包含E7表达细胞以及对照细胞)和原代角质化细胞PHKs(包含E7表达细胞以及对照细胞)细胞中进行实时定量PCR检测。结果发现这些基因与RNA-seq分析结果一致,而且E7表达细胞与对照细胞之间的差异具有明显统计学意义。接下来我们对E7表达细胞中具有差异表达的237种基因进行生物信息学的分析,通过GO(Gene Ontology)注释和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库聚类分析发现与DNA复制、DNA修复以及核苷酸代谢等促进细胞周期进展的信号通路在E7表达细胞中明显上调,而参与程序性细胞死亡以及分解代谢调节的信号通路在E7表达细胞中明显下调。考虑到与细胞周期和DNA复制通路相关的基因在E7表达细胞中明显失调,我们选择了参与DNA复制和G1检验点调节的WDHD1进行了进一步研究,结果发现WDHD1的mRNA及蛋白水平在E7表达细胞中均升高,而低危型E7(6E7)并不能使WDHD1 mRNA及蛋白水平升高。我们同时也发现WDHD1在E7表达细胞中的半衰期比对照细胞明显延长。为了检测WDHD1在E7表达细胞中能否发挥其细胞周期调控的作用,我们首先加入博来霉素使对照细胞不能越过G1检验点的情况下,E7细胞仍然能够越过G1检验点,接着分别转入WDHD1的两个小干扰序列,结果发现随着WDHD1的敲除,细胞发生G1期阻滞。这表明WDH D1蛋白通参与调控E7细胞G1检测点。值得注意的是,当E7表达细胞部分敲除WDHD1达到和对照细胞表达量相同时,也就是不影响细胞的正常DNA复制时,该细胞仍然停滞G1期。这表明WDHD1蛋白是通过一种非依赖与DNA复制起始的机制,进一步调控E7细胞G1检测点。为了更直接验证WDHD1促进细胞进入S期的功能,我们采取了BrdU的方法,结果发现在E7表达细胞中当敲除WDHD1后BrdU的插入量明显减少。这些均表明在HPV E7表达细胞中WDHD1在细胞周期G1期调控以及S期的进入过程均发挥着重要作用。我们最近研究表明,HPV-16 E7表达细胞在DNA损伤情况下会发生重复复制,并且DNA复制的启动因素Cdt1在此过程中扮演着重要的角色。既然WDHD1被认为是DNA复制起始因子,那么它是否影响E7细胞的重复复制呢?首先我们将E7表达细胞同步化在G1期,然后进行不同时间点的释放,发现随着时间的延长细胞发生了重复复制。当敲除WDHD1后发现细胞的重复复制是明显降低的。那么在E7表达细胞中WDHD1是如何调控重复复制的呢?已知DNA复制起始因子招募MCM家族成员到复制起始区域从而启动DNA复制,WDHD1的HMG box也具有与DNA结合的特性,因此WDHD1是否会通过MCM家族的成员来调控DNA复制呢?结果我们发现MCM3结合到E7表达细胞启动子区域的量要高于对照细胞,而当敲除WDHD1后MCM3结合到启动子区域的量是下降的,同时WDHD1也能够影响MCM3的mRNA及蛋白水平。当敲除MCM3后细胞的重复复制也是明显降低的。综上所述,WDHD1蛋白能够调控E7细胞的G1检验点及DNA复制和重复复制,这些过程主要是依赖与WDH D1调控MCM3来完成的。第二部分WDHD1在HPV诱发的肿瘤及其他肿瘤中的调节机制人类的多种疾病包括癌症、自身免疫系统疾病以及炎症性疾病的发生发展都有细胞信号转导与转录激活因子(STATs)的参与。STATs家族成员含有多个保守结构域和功能性结构域,其中最为保守的结构域是SH2结构域。当细胞受到刺激时,STAT3作为转录因子其SH2结构域与受体上被磷酸化的酪氨酸残基结合,同时STAT3自身发生磷酸化。STAT3在细胞内起着重要的信号传递作用,主要负责将细胞外的信号传递到细胞核内,进一步与靶基因启动子结合从而诱导靶基因转录。目前许多STAT3的靶基因已被确定,包含编码抗凋亡蛋白的Bcl-2、Bcl-X和Mcl-1,增值相关蛋白Myc和Cyclin D1,以及促血管生成因子VEGF等。通过对RNA-seq数据进行生物信息学分析,我们发现STAT3在E7细胞的基因表达调控中发挥着举足轻重的作用。首先STAT3和WDHD1的mRNA水平在E7细胞中均是升高的,另外我们发现WDH D1启动子区域有3个STAT3的结合位点。那么STAT3是否具有WDHD1调控细胞DNA复制的功能以及是否能调控WDHD1呢?以下的所有数据在E7表达细胞、肠癌细胞和乳腺癌细胞等多种细胞中均得到了验证,篇幅所限,我们将展示肠癌和乳腺癌细胞的结果。我们发现在乳腺癌MCF-7细胞中,敲除STAT3后细胞DNA复制减少,而将STAT3过表达后细胞的DNA复制会增多,说明STAT3在DNA复制过程中起作用。MLN4924可以诱导肠癌细胞HCT116发生重复复制,当敲除STAT3后细胞重复复制明显减少,提示STAT3在重复复制过程中也发挥作用。当用STAT3的激活因子IL-6以及EGF处理后发现WDHD1的mRNA也是增多的。既然STAT3不仅具有影响DNA复制和重复复制的功能,而且影响WDHD1的mRNA以及蛋白水平,那么STAT3是如何调控WDHD1的呢?STAT家族识别的经典DNA结合序列是TTCC(C or G)GGAA(或TTN5AA),且我们发现WDHD1启动子区域有3个STAT3的结合位点。我们通过实验证明STAT3确实能够通过结合该3个位点来启动WDHD1的转录。以上结果说明,STAT3能够调控WDHD1,当STAT3表达下降时细胞的DNA复制及重复复制均减少。那么在STAT3表达下降的前提下再高表达WDHD1(使WDHD1表达量恢复到原水平),下降的DNA复制和重复复制会恢复吗?结果发现由STAT3的减少引起的细胞DNA复制和重复复制在WDHD1重新高表达的情况下又恢复了。综上所述,STAT3可以通过与WDHD1启动子区域的结合位点结合从而促进WDHD1基因转录,WDHD1通过影响MCM3进而影响细胞DNA复制和重复复制。我们的研究阐明了高危型HPV诱发肿瘤发生的机制,同时也为临床寻找新的治疗宫颈癌以及其他肿瘤的策略提供理论支持。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33

【参考文献】