妊娠肝内胆汁淤积症患者尿液microRNA谱和代谢组学研究

发布时间：2019-01-08 13:28

【摘要】：背景妊娠肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是一种妊娠期相关的并发症。该疾病有明显的地域性,发病率从0.1%到15.6%不等。临床表现为孕晚期出现轻度至重度瘙痒和肝功能异常,但疾病的症状和肝功能异常在分娩后一周内迅速恢复。然而,该疾病却对母亲和胎儿产生严重的影响。对于母体的影响主要是顽固性瘙痒和易于产后出血而导致产妇死亡率增加。对胎儿的影响就更为严重,该疾病会增加胎儿自发性早产、胎儿宫内窘迫和宫内死亡的风险。目前,ICP确切的致病原因尚不清楚,普遍认为遗传、激素、营养和环境因素与疾病的发病机制相关。ICP的诊断也没有统一标准,国内临床诊断主要依据瘙痒和排除其它疾病的肝功异常。总胆汁酸(total bile acid,TBA)的增高被认为是诊断ICP最重要的实验室指标,然而某些ICP病例其TBA水平仍保持正常水平。因而选取更灵敏和特异的指标对ICP患者尽早进行诊断以及改善预后具有显著的意义。循环micro RNA(mi RNA)广泛存在于多种体液中,它的水平能反应组织的特异损伤和表达,含量稳定并易于检测。循环mi RNA可作为一种理想的无创性生物标志物。基于液质联用的非靶向代谢组学技术可对复杂生物体系的大量代谢物同时进行分析,非常适用于生物标志物的发现研究。目的针对目前临床上尚无诊断ICP的灵敏、特异的生物标志物且ICP的发病机制尚未明确的研究状况,本研究以尿液为研究载体,利用多平台筛选诊断ICP的标志物。方法本研究选取ICP孕妇和正常孕妇尿样各10例,用定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法对人360种成熟mi RNA进行初筛。另选取ICP孕妇尿液样本50例和正常孕妇尿样本60例作为验证组,对初筛的候选mi RNA采用q RT-PCR法验证。用回归模型获得诊断ICP的最优模式,寻找灵敏、特异的mi RNA标志物并用受试者特征工作(receiver operating characteristic,ROC)曲线进行评估。本研究同时从上述病例中选取了ICP孕妇和正常孕妇尿样各30例,采用基于高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry,HPLC-Q-TOF MS)的非靶向代谢组学方法考察ICP疾病发生时尿液代谢物的变化。采用有监督和无监督模型筛选代谢标志物,对候选标志物采用统计学方法、回归原始数据筛选及构建无信息模型验证标志物。用HMDB数据库和同位素比对的方法鉴定标志物并进行代谢通路分析。用回归模型获得诊断ICP的最优模式,寻找灵敏、特异的代谢标志物,用ROC曲线进行评估。1.与正常孕妇相比,ICP孕妇尿样中23种mi RNA的表达水平有明显差异,其中14种mi RNA上调(P0.05),9种mi RNA下调(P0.05)。这23种mi RNA的热图可以区分ICP组与正常孕妇组。2.经验证ICP孕妇与正常孕妇尿液的mi RNA表达水平相比hsa-mi R-151-3p,has-mi R-489,and hsa-mi R-300的表达明显降低;hsa-mi R-16,hsa-mi R-671-3p,and hsa-mi R-369-5p的表达水平明显增高。3.二元logistic回归模型评估差异表达的6个mi RNA诊断ICP效率,显示hsa-mi R-151-3p,hsa-mi R-671-3p,hsa-mi R-369-5p和hsa-mi R-300对ICP有显著的诊断价值。联合这4种mi RNA构建的ROC曲线下面积为0.913,准确度为82.9%,特异度为87.0%。4.优化后的色谱条件下代谢物成分丰富,峰分布均匀。建立尿液非靶向代谢组学方法正离子模式下天内保留时间变异小于1.9%,峰面积变异小于11.3%,天间保留时间变异小于4%,峰面积变异小于16.6%;负离子模式下天内保留时间变异小于3%,峰面积变异小于12.5%,天间保留时间变异小于3.8%,峰面积变异小于14.1%。5.经数据处理峰识别、峰过滤与峰对齐后正模式下获得986个代谢物,负模式下获得647个代谢物。构建的正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least square-discriminate analysis,OPLS-DA)模型可以区分ICP组与正常孕妇组;根据模型变量投影的重要性(variable importance in the projection,VIP)值大于1且t检验P值小于0.05筛选变量,正离子获得109个,而负离子模式下获得119个。6.正离子模式下鉴定出14种差异化合物;负离子模式下鉴定出结果18种差异化合物。这些化合的代谢多涉及胆汁酸的合成与代谢、激素代谢和脂代谢。7.二元logistic回归模型评估发现代谢产物单酰基甘油(22:5)、溶血磷脂酰乙醇胺(22:5)、硫酸化半胱氨酸、甘氨胆酸和3-硫酸化鹅脱氧胆酸对ICP有显著的诊断价值。这些代谢物作为联合诊断指标构建的ROC曲线下面积为0.988,灵敏度为90%,特异性为93.3%。结论1.ICP孕妇尿液某些mi RNA与正常孕妇存在明显差异。2.hsa-mi R-151-3p,hsa-mi R-671-3p,hsa-mi R-369-5p和hsa-mi R-300可联合诊断ICP,有较高的灵敏度和特异性。3.ICP孕妇尿液与正常孕妇尿液的代谢谱存在明显差异。这些代谢多涉及胆汁酸的合成与代谢、激素代谢和脂代谢,揭示ICP的发生可能与这些代谢物的紊乱有关。4.代谢产物单酰基甘油(22:5)、溶血磷脂酰乙醇胺(22:5)、硫酸化半胱氨酸、甘氨胆酸和3-硫酸化鹅脱氧胆酸是潜在诊断ICP的标志物,联合诊断ICP有高的特异性和灵敏度。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.255;R446.1

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