MiR-200a调控卵巢上皮癌化疗敏感性、增殖及CSCs的作用及其机制研究

发布时间：2019-01-12 20:45

【摘要】：研究背景 卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer, EOC)的病死率高居妇科恶性肿瘤之首,晚期患者的5年生存率仅约30%。目前,肿瘤细胞减灭术联合铂类药物为基础的化疗,对约70%的晚期患者初期治疗有效,但大部分患者最终会出现化疗耐药导致疾病复发。因此,深入认识EOC的进展机制,有效改善EOC的不良预后是目前临床亟待解决的难题。 新近的研究发现,EOC化疗耐药与上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)密切相关。EMT是指上皮细胞表面黏附分子表达降低、细胞间连接变得疏松、细胞骨架重塑,转变成间充质细胞表型过程。已有的研究证实EMT在肿瘤侵袭、转移和化疗耐药中具有重要的调控作用。更重要的是,有研究发现EOC中存在的肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)具有EMT的特征。CSCs学说认为：肿瘤是由异质性的细胞群体构成；其中存在极少量具有干细胞性质的癌细胞亚群,是肿瘤发生、进展、转移及耐药性产生的根源。因此,抑制EMT可能成为有效改善EOC预后的策略。 微小RNA(microRNA, miRNA, miR)是一类非编码的单链小分子RNA,长度约18-24个核苷酸(nucleotide, nt),其通过与mRNA3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)碱基识别配对,调控靶基因的表达。目前已发现miRNAs在调控EMT中具有重要作用,亦与多种肿瘤的发生及进展关系密切。Yang,等分析了459例EOC肿瘤组织的mRNA及miRNAs表达谱特征,证实间充质表型与EOC的不良预后相关,包括miR-20a、miR-141和miR-506在内的8个关键miRNA,调控了高达89%的间充质相关基因表达。 miR-200a和miR-141同属于miR-200家族(miR-200s,包括miR-200a/b/c/和miR-141/429共5个miRNA)。近年的研究发现miR-200s在多种肿瘤中具有阻碍EMT进程、抑制CSCs自我更新和去分化状态、调控细胞增殖及凋亡、逆转化疗耐药的作用。在EOC中已证实miR-200s的表达水平与化疗敏感性、无进展生存期(progression-free survival, PFS)以及总生存期(overall survival, OS)呈正相关。这些研究结果说明以miR-200s作为EOC潜在的治疗策略,具有理论上的可行性和积极的临床意义。 有研究证实,在EOC细胞株Hey中,过表达miR-200c通过靶向调控TUBB3增加了紫杉醇的敏感性。我们前期在卵巢浆液性腺癌细胞系--OVCAR-3中验证了CD133+细胞具有CSCs特征；进一步用miRNA芯片发现CD133+与CD133-细胞间存在miRNAs的差异表达谱；其中miR-200a在CD133+细胞中下调了约2.16倍,利用合成的miR-200a模拟物—miR-200a mimics,在CD133±细胞中瞬时上调miR-200a水平,发现miR-200a通过靶向下调ZEB2抑制了CD133+细胞的迁移和侵袭能力,初步证实miR-200a在EOC中具有抑制转移的积极作用。但目前关于miR-200a对EOC化疗敏感性和CSCs的调控作用及其相关机制尚未完全阐明。 我们发现瞬时转染,miR-200a mimics的方法仅适用于短期内观察,miR-200a对EOC细胞的影响；并且分选得到的CD133+细胞所占比例非常低(约0.2-1%)；另外,CD133+细胞在体外培养过程中逐渐分化为CD133-细胞的问题,都将为我们深入探索miR-200a在EOC中的生物学功能带来一定的局限性。近来,Wang,等用基因芯片鉴定了无血清培养OVCAR-3所形成的悬浮生长细胞球,具有CSCs的特征,适宜作为研究EOC中CSCs的体外模型。 综合考虑上述因素,本课题首先利用慢病毒表达载体成功构建了稳定上调miR-200a的EOC细胞模型,在普通贴壁培养和悬浮培养条件下,验证了miR-200a对EOC化疗敏感性的影响；进一步探索了miR-200a调控EOC增殖状态和CSCs的作用及其机制,以期为改善EOC的预后带来更新更有力的治疗策略。 第一章构建稳定高表达miR-200a的EOC细胞模型 目的： 利用慢病毒表达载体,构建稳定高表达miR-200a的贴壁及悬浮生长EOC细胞模型,为深入探索miR-200a对EOC的生物学作用及其机制提供平台。 方法： 1. miR-200a过表达慢病毒载体和对照空载体的鉴定。 miR-200a过表达慢病毒载体pLV-miR-200a和对照空载体pLV-control购自深圳市华安平康生物科技有限公司。通过质粒转化、质粒扩增、质粒提取、PCR扩增、DNA电泳以及DNA测序,鉴定miR-200a慢病毒表达载体和对照空载体。 2. miR-200a过表达慢病毒和对照慢病毒的包装。 慢病毒包装元件psPAX2和pMD2.G由南方医科大学肿瘤研究所提供,pLV-miR-200a或pLV-control、psPAX2和pMD2.G共同组成慢病毒包装系统。用Lipofectamine2000将慢病毒包装系统转染293T细胞,包装生产携带miR-200a过表达的慢病毒和对照慢病毒。 3. miR-200a过表达慢病毒和对照慢病毒感染EOC细胞。 用携带]miR-200a过表达的慢病毒和对照慢病毒,分别感染EOC细胞株OVCAR-3,在倒置荧光显微镜下观察报告基因一绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)的表达,以监测感染效率,应用流式细胞仪分选GFP+细胞。 4.验证miR-200a在感染后EOC细胞中的表达水平。 提取经流氏细胞仪分选后EOC细胞的总RNA, qRT-PCR检测miR-200a的表达水平,大量扩增并冻存高表达miR-200a的EOC细胞和对照细胞,用于后续实验。 5.建立miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞模型。 收集过表达miR-200a的贴壁生长EOC细胞和对照组细胞,分别用PBS洗涤2次,重悬于肿瘤球培养基(含EGF20ng/mL、bFGF10ng/mL、0.4%BSA、 insulin5μg/mL、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的DMEM/F12),接种于超低吸附培养皿,常规条件培养,间隔72h添加适量肿瘤球培养基,7d后收集球体细胞,用0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶1：1混合液消化球体细胞,继续用上述方法传代培养,得到悬浮生长的EOC细胞。qRT-PCR检测悬浮生长的EOC细胞中miR-200a的表达水平。 6.利用SPSS16.0统计软件对所有数据进行处理,采用单样本t检验分析贴壁及悬浮生长EOC细胞中miR-200a的表达差异,显著性水平定义α=0.05,P0.05认为差异有统计学意义,数据用“均数士标准差”表示。 结果： 1.DNA测序证实miR-200a过表达慢病毒载体和对照空载体序列均正确。 2.成功生产了miR-200a过表达慢病毒和对照慢病毒,用以感染EOC细胞株OVCAR-3,感染后在倒置荧光显微镜下可见GFP十细胞的表达率约为20%-30%,进一步用流式细胞仪分选GFP+细胞,得到感染效率约为95%的EOC细胞。 3.成功构建了miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞模型。qRT-PCR验证携带miR-200a转基因的贴壁生长EOC细胞与对照细胞相比,miR-200a的表达水平升高(3.67±0.45)倍。统计分析结果提示,携带miR-200a转基因的贴壁生长EOC细胞和对照细胞,miR-200a的表达差异具有统计学意义(t值=10.187,P=0.009)。 4.成功构建miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞模型。qRT-PCR验证携带miR-200a转基因的悬浮生长EOC细胞与对照细胞相比,miR-200a的表达水平升高(2.05±0.39)倍。统计分析结果提示,携带miR-200a转基因的悬浮生长EOC细胞和对照细胞,niR-200a的表达差异具有统计学意义(t值=4.666,P=0.043)。 结论： 成功将目的基因miR-200a整合入EOC细胞中并实现高效表达,建立了稳定过表达miR-200a的贴壁及悬浮生长EOC细胞模型。 第二章MiR-200a对EOC化疗敏感性、增殖及CSCs的调控作用及其机制 第一节MiR-200a对EOC化疗敏感性的调控作用 目的： 在稳定过表达miR-200a的贴壁及悬浮生长EOC细胞模型中,验证miR-200a对EOC化疗敏感性的调控作用。 方法： 1.MTT检测miR-200a;对贴壁生长EOC细胞化疗敏感性的影响。 收集miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照细胞,分别重悬于含10%FBS的RPMI1640培养基。按5x103细胞／孔接种于普通96孔板内,培养12-16h后,在细胞中分别加入不同浓度的紫杉醇(终浓度分别为：2nM,4nM,8nM,16nM,32nM)或顺铂(终浓度分别为：lug/mL,2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL),每个浓度设4个重复孔。药物作用48h后,每孔中加入201μL细胞活力检测试剂MTT(5mg/mL),继续常规培养4h后,小心弃去细胞上清液,每孔分别加入100uL DMSO,避光震荡混匀后,置酶联检测仪上测定各孔光密度(OD)值,检测波长490nm。细胞存活率(SR)按以下公式计算：加药孔吸光度平均值／空白对照组吸光度平均值x100%。实验重复三次。 2.MTT检测miR-200a;对悬浮生长EOC细胞化疗敏感性的影响。 收集miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞和对照细胞,分别重悬于肿瘤球培养基,按1x104细胞／孔接种于超低吸附96孔板内,培养24h后,在细胞中分别加入不同浓度紫杉醇(终浓度分别为：2nM,8nM,32nM,128nM,512nM)或顺铂(终浓度分别为：2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL),每个浓度设4个重复孔。药物作用72h后,每孔中加入20μL细胞活力检测试剂MTT(5mg/mL),继续培养4h后,箱式离心机3000rpm离心15min,此时可见肿瘤球细胞聚集于孔板的一侧,用1mL注射器小心吸弃上清液,每孔分别加入100uLDMSO,避光震荡混匀后,置酶联检测仪上测定各孔光密度(OD)值,检测波长490nm。细胞存活率(SR)按以下公式计算：加药孔吸光度平均值/空白对照组吸光度平均值x100%。实验重复三次。 3.利用SPSS16.0统计软件对所有数据进行处理,采用析因设计的方差分析和两个独立样本的t检验,分析细胞毒性试验中细胞存活率之间的差异。P0.05认为差异有统计学意义,数据用“均数士标准差”表示。 结果： 1. miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照组细胞,在紫杉醇的终浓度为：2nM,4nM,8nM,16nM,32nM时,细胞存活率(%)分别为：(85.86±4.16vs.87.80±2.22),(74.66±3.19vs.80.62±2.60),(65.85±4.24vs.76.15±4.46),(54.91±4.43vs.69.53±3.31),(54.62±1.76vs.66.91±3.41)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞与对照组细胞,紫杉醇细胞毒性之间的差异总体有统计学意义(F值=63.464,P值0.001)。 miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照组细胞,在顺铂的终浓度为：1ug/mL,2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mLL时,细胞存活率(%)分别为：(90.24±5.00vs.85.60±3.60),(66.96±3.57vs.71.95±6.68),(62.02±2.57vs.66.46±2.89),(54.45±2.63vs.56.89±2.80),(49.39±4.21vs.46.61±2.75),(43.54±4.34vs.42.38±2.18)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞与对照组细胞,顺铂细胞毒性之间的差异总体没有统计学意义(F值=0.247,P值=0.622)。 2. miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞和对照组细胞,在紫杉醇的终浓度为：2nM,8nM,32nM,128nM,512nM时,细胞存活率(%)分别为：(69.27±3.63vs.83.43±4.01),(57.03±2.88vs.78.91±0.86),(57.47±1.31vs.80.89±1.29),(57.69±1.35vs.80.11±1.80),(55.17±0.60vs.77.96±3.75)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞与对照组细胞,紫杉醇细胞毒性之间的差异总体有统计学意义(F值=721.813,P值0.001)。 miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞和对照组细胞,在顺铂的终浓度为：2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL时,细胞存活率(%)分别为：(50.80±2.35vs.54.37±1.86),(42.64±2.80vs.41.71±1.62),(49.66±2.03vs.46.92±6.37),(46.84±7.72vs.51.57±5.25),(42.66±2.98vs.45.54±5.36)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞与对照组细胞,顺铂细胞毒性之间的差异总体没有统计学意义(F值=1.191,P值=0.284)。 结论： miR-200a过表达增加了贴壁和悬浮生长的EOC细胞对紫杉醇的敏感性,没有影响贴壁和悬浮生长的EOC细胞对顺铂的敏感性。 第二节MiR-200a对EOC细胞增殖状态的调控作用 目的： miR-200a具有提高贴壁和悬浮生长的EOC细胞对紫杉醇敏感性的作用,而对顺铂的敏感性没有影响；考虑到紫杉醇是靶向细胞增殖周期的药物,而顺铂为非细胞周期依赖药物,所以有必要进一步探索miR-200a对EOC细胞增殖状态的影响。本部分通过一系列体内、外实验验证了miR-200a对EOC细胞增殖状态的调控作用。 方法： 1.平板克隆形成实验检测]miR-200a;对贴壁生长EOC细胞增殖状态的影响。 收集lniR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照细胞,重悬于含10%FBS的RPMI1640培养基,按1.5x102细胞/孔接种于普通6孔板内,每组设3个复孔,常规培养10d,观察细胞克隆的形态,计数大于50个细胞的克隆数,弃掉培基,PBS小心漂洗3遍,甲醇固定10min,苏木素染色5-10min,自来水小心漂洗后,拍照记录克隆外观。计算克隆形成率=(克隆数／接种细胞数)x100%。 2.生长曲线(CCK8法)实验检测]miR-200a对贴壁及悬浮生长EOC细胞增殖状态的影响。 收集miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照细胞,重悬于含10%FBS的RPMI1640培养基,按2.0×103细胞／孔接种于普通96孔培养板中,每组设6个复孔,培养6h、1、2、3、4、5、6d时,加入CCK8与培基混合液110μL(比例为1：10),继续常规培养1.5h,以空白对照孔调零,置酶联检测仪上测定各孔光密度(OD)值,检测波长450nm,以相对应OD值代表细胞增殖状态,各组取6孔OD值的平均值,绘制细胞增殖曲线。 收集miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞和对照细胞,重悬于肿瘤球培养基,按4.0×103细胞／孔接种于超低吸附96孔培养板中,每组设6个复孔,培养1、2、3、4、5、6、7d时,加入CCK8液10μL,继续常规培养4h,以空白对照孔调零,置酶联检测仪上测定各孔光密度(OD)值,检测波长450nm,以相对应OD值代表细胞增殖状态,各组取6孔OD值的平均值,绘制细胞增殖曲线。 3.流式细胞仪检测miR-200对贴壁及悬浮生长EOC细胞细胞周期分布的影响。 分别收集]miR-200a过表达及对照的贴壁和悬浮生长EOC细胞,用预冷PBS漂洗细胞两次,加入预冷70%乙醇,4℃固定过夜或-20℃长期固定,检测前PBS漂洗细胞一次,加入含50μg/mL溴化乙锭(PI)、100μg/mL RNase A、0.2%TritonX-100的PBS500μL,室温避光孵育30分钟,以标准程序用流式细胞仪检测,计数1～2万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析结果。 4.体内验证miR-200a对EOC细胞增殖状态的影响。 选取4-5周龄雌性BALB/c-nu/nu裸鼠作为实验对象,将miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照组细胞,分别皮下注射移植入裸鼠背部的右侧及左侧,每侧移植1.5x106个细胞,细胞悬液总体积为100μL。实验共用8只裸鼠,每3日观察裸鼠一般情况、测量接种部位包块生长情况并记录裸鼠体重,依据移植瘤生长情况适时取材并作相关分析。 5.取移植瘤组织免疫组化检测Ki67的表达情况,光学显微镜下观察拍照,随机选取3个高倍视野,计算每个视野阳性细胞比例。阳性细胞比例=每个视野下阳性细胞数/每个视野下细胞总数×100%。 6.利用SPSS16.0统计软件对所有数据进行处理,采用两个独立样本t检验分析平板克隆形成率差异、移植瘤组织中Ki67阳性率差异、细胞周期分布差异。采用析因设计的方差分析,分析生长曲线(CCK8法)及裸鼠皮下移植瘤生长差异,P0.05认为差异有统计学意义,数据用“均数士标准差”表示。 结果： 1.平板克隆实验中,miR-200过表达的贴壁生长EOC细胞较对照组细胞,体积缩小、细胞排列更紧密,更倾向于上皮细胞表型；miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞与对照组细胞的克隆形成率(%)分别为(92.52±5.60vs.79.12±4.41)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞与对照组细胞,克隆形成率的差异具有统计学意义(t值=-4.461,P值=0.001)。 2.生长曲线(CCK8法)实验中,miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照组细胞,在培养8h、1、2、3、4、5、6d时,吸光度值(OD)分别为(0.278±0.008vs.0.275±0.002),(0.500±0.096vs.0.433±0.035),(0.624±0.058vs.0.528±0.046),(1.028±0.115vs.0.710±0.048),(1.530±0.160vs.1.000±0.171),(1.993±0.206vs.1.239±0.159),(2.450±0.233vs.1.428±0.161)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞与对照组细胞,细胞增殖的差异总体具有统计学意义(F值=199.507,P值0.001)。 miR-200过表达的悬浮生长EOC细胞和对照组细胞,在培养1、2、3、4、5、6、7d时,吸光度值(OD)分别为(0.218±0.015vs.0.216±0.013),(0.333±0.013vs.0.323±0.014),(0.462±0.028vs.0.437±0.021),(0.720±0.078vs.0.565±0.050),(0.952±0.081vs.0.688±0.062),(1.149±0.116vs.0.803±0.054),(1.434±0.135vs.0.957±0.080)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞与对照组细胞,细胞增殖的差异总体具有统计学意义(F值=159.036,P值0.001)。 3.流式检测细胞周期实验中,miR-200过表达的贴壁生长EOC细胞和对照组细胞,G0/G1、S、G2/M期所占比例(%)分别为(55.86±2.55vs.72.41±3.22),(26.15±2.30vs.21.76±2.11),(13.52±1.99vs.6.82±0.76)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞与对照组细胞,G0/G1、S、G2/M期比例的差异分别为(t值=9.861,P值0.001)、(t值=-3.445,P值=0.006)、(t值=-7.686,P值0.001),均具有统计学意义。 miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞和对照组细胞,Go/G1、S、G2/M期所占比例(%)分别为(69.52±3.24vs.90.48±2.36),(21.35±2.10vs.5.49±0.52),(11.31±1.43vs.3.32±0.28)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的悬浮生长EOC细胞与对照组细胞,G0/G1、S、G2/M期比例的差异分别为(t值=11.470,P值0.001)、(t值=-17.926,P值=0.006)、(t值=-13.386,P值0.001),均具有统计学意义。 4.裸鼠皮下移植瘤实验中,miR-200过表达的EOC细胞和对照细胞均能在裸鼠皮下生长形成肿瘤。miR-200a过表达的皮下移植瘤和对照移植瘤体积(mm3),在皮下接种移植后50、53、56、59、62d分别为(110.27±57.84vs.58.19±19.55),(146.88±73.64vs.67.44±32.58),(167.03±75.68vs.82.25±48.15),(234.01±80.85vs.108.74±42.98),(366.36±99.87vs.137.44±43.13)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的EOC细胞与对照组细胞,裸鼠皮下移植瘤增长的差异总体具有统计学意义(F值=63.441,P值0.001)。 5.免疫组化检测移植瘤组织中Ki67表达的实验中,miR-200a过表达和对照移植瘤组织中Ki67阳性表达率(%)为(70.91±5.18vs.15.21±3.52)。统计分析结果提示,miR-200a过表达和对照移植瘤组织中,Ki67阳性表达率差异具有统计学意义(t值=-25.156,P值0.001)。 结论： 1.过表达miR-200a增加了EOC细胞平板克隆形成率；促进了贴壁及悬浮生长EOC细胞的生长、诱导其进入增殖周期；有益于EOC细胞裸鼠皮下移植瘤生长；说明miR-200a具有促进EOC细胞的增殖的作用。这种促增殖效应可能是miR-200a增加EOC细胞对紫杉醇敏感性的作用机制之一。 第三节MiR-200a调控EOC中CSCs的作用及其机制 目的： 以上研究发现miR-200a对EOC细胞株紫杉醇敏感性及增殖状态具有一定的调控作用,接下来我们拟探索miR-200a调控EOC中CSCs的作用及其机制。通过肿瘤球形成实验、流氏细胞仪检测侧群(side population,SP)细胞比例、检测CSCs特性相关基因表达水平,验证miR-200a对EOC中CSCs干性特征的调控作用及其机制。 方法： 1.肿瘤球形成实验检测miR-200a对EOC细胞自我更新能力的影响。 收集miR-200a过表达的EOC细胞和对照细胞,重悬于肿瘤球培养基,按1×103细胞/孔分别接种于超低吸附24孔板内,每组三个复孔,常规培养7d,倒置荧光显微镜下观察肿瘤球形态,计数直径≥-70μm的肿瘤球个数。实验重复三次。 2.流氏细胞仪检测SP细胞比例,验证miR-200a对EOC中CSCs比例的影响。 收集miR-200a过表达的贴壁生长EOC细胞和对照组细胞,重悬于已预热为37℃含2%FBS的RPMI1640培养基,调整细胞密度至1×106/mL,每组各准备两管细胞,四管细胞中均加入Hoeehst33342终浓度为5ug/mL,在每组细胞中随机选择一管再加入维拉帕米终浓度为50μmol/L,37℃摇床避光孵育90min后放于冰上终止反应。4℃1000rpm离心3min,弃上清,预冷PBS洗涤一次。40μm滤器过滤待检测细胞,检测前加入碘化丙淀(PI)终浓度1μg/mL标记死细胞。流式细胞仪检测SP比例,Hoeehst33342激发光波长为350nm,405/30带通收集蓝光,570/20带通收集红光,PI用488nm蓝光激发,630/30带通收集红光。去除PI直接染色阳性的死细胞,以Hoechst Red为X轴,Hoechst Blue为Y轴作二维散点图。设门选低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域为SP细胞。比较SP细胞比例在miR-200a过表达的EOC细胞与对照组细胞间的差别。 3. qRT-PCR和Western Blot检测miR-200a对EOC细胞中CSCs相关基因表达的调控作用。 qRT-PCR检测方法如下,提取miR-200a过表达的EOC细胞和对照组细胞总RNA,将mRNA逆转为cDNA, qRT-PCR检测(SYBR法)SOX2和OCT4mRNA水平,以GAPDH作为内源性对照。 Western Blot检测方法如下,提取miR-200a过表达的EOC细胞和对照组细胞总蛋白,BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度,每个泳道加30μg蛋白样品,SDS-PAGE将蛋白分离后转移到PVDF膜上,3%BSA拮抗非特异性位点,分别用SOX2和OCT4的一抗(稀释比例1：1000),4℃孵育过夜,相应二抗室温孵育1h,增强型化学发光系统(ECL)观察蛋白印迹,以P-actin作为内源性对照。 4.利用SPSS16.0统计软件对所有数据进行处理,采用两个独立样本的t检验分析肿瘤球形成差异、SP细胞比例差异,单样本的t检验分析qRT-PCR和Western Blot检测SOX2和OCT4表达差异。P0.05认为差异有统计学意义,数据用“均数士标准差”表示。 结果： 1.肿瘤球形成实验中,我们观察到有部分miR-200a过表达的EOC细胞,在超低吸附培养皿中亦可贴壁生长,并以贴壁方式逐渐增殖,而对照组中几乎没有肿瘤球细胞贴壁生长的现象。miR-200a过表达的EOC细胞和对照细胞,肿瘤球形成个数(/1000个细胞)分别为(7.17±1.17vs.17.50±1.87)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的EOC细胞与对照组细胞,肿瘤球形成个数差异具有统计学意义(t值=11.474,P值0.001)。 2.流式细胞仪检测SP细胞比例的实验中,miR-200a过表达的EOC细胞和对照细胞SP细胞比例(%)为(0.233±0.076vs.0.850±0.100)。统计分析结果提示,miR-200a过表达的EOC细胞和对照细胞,SP细胞比例差异具有统计学意义(t值=8.488,P值=0.001)。 3. qRT-PCR检测miR-200a过表达的EOC细胞中SOX2和OCT4mRNA水平分别下降至对照细胞的0.467和0.361倍。统计分析结果提示,miR-200a过表达的EOC细胞与对照组细胞,SOX2和OCT4mRNA水平差异均具有统计学意义(t值=-10.932,P=0.008)和(t值=-17.416,P值=0.003)。 Western Blot结果提示miR-200过表达的EOC中细胞中,SOX2和OCT4蛋白表达水平分别下降至对照细胞的0.546和0.518倍。统计分析结果提示,miR-200a过表达的EOC细胞与对照组细胞,SOX2和OCT4蛋白水平差异均具有统计学意义(t值=-10.191,P值=0.009)和(t值=-9.659,P值=0.011)。 结论： 过表达miR-200a通过抑制EOC细胞自我更新能力、诱导分化、降低SP细胞比例、下调干性相关基因SOX2和OCT4的表达,弱化了EOC中CSCs的干性特征。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】

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1 王伟;王沂峰;张岭梅;林琼燕;黄菊;;人卵巢癌OVCAR3细胞系中侧群细胞的分离及其成瘤性、侵袭性的实验研究[J];山东大学学报(医学版);2009年06期

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本文编号：2408171