孕期乙醇暴露对大鼠脑内TLR4介导的固有免疫应答的影响

发布时间：2019-01-26 16:05

【摘要】：乙醇可影响大脑发育，孕期乙醇暴露可诱发新生儿神经发育迟滞及精神发育障碍，是最主要的预测出生缺陷的因素之一。神经胶质细胞具有保护、滋养神经元的作用，也是神经系统中发挥免疫功能的细胞。血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的存在使中枢神经系统（central nervous system, CNS）与外界的物质交换受到了严格的限制。CNS的固有免疫反应与多种神经和精神性疾病的发生、发展有着密切的关系。TLR4（toll-like receptor4）是CNS固有免疫应答识别抗原物质的重要分子，目前对TLR4介导的固有免疫应答通路的研究已较为广泛和深入，但乙醇暴露对该通路是否存在影响仍无定论。本研究围绕CNS TLR4介导的固有免疫应答反应，分三个部分探讨孕期乙醇暴露对新生儿CNS发育的影响。第一部分：分别于新生大鼠（生后1,3,7,14,21天）侧脑室（0.3mg/kg,1mg/ml）和腹腔内（0.3mg/kg,1mg/ml）注射小剂量脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），12小时后以实时定量PCR及Western Blot检测全脑中TLR4mRNA以及myeloiddifferentiation factor88(MyD88)，nuclear factor-kappa Bp50(NF-κBp50)蛋白的表达。并于新生大鼠（生后1,3,7天）腹腔和侧脑室注射LPS（剂量同前），12小时后脑部切片行Iba-1和RECA双标的免疫荧光染色。伊文思蓝（evans blue, EB）渗透实验观察新生大鼠（生后1,3,7天）腹腔注射LPS（0.3mg/kg,0.01mg/ml）12小时后全脑切片是否有EB的渗出。透射电镜观察新生大鼠（生后1,3天）腹腔注射LPS （0.3mg/kg,0.01mg/ml）12小时后脑部超微结构的变化。结果：即使在出生后1天内，新生大鼠CNS也能对脑内注射的LPS做出强烈反应。TLR4mRNA以及MyD88，NF-κBp50蛋白的表达量显著升高，Iba-1特异性标记的小胶质细胞被激活，，并且激活的小胶质细胞分布于脑内各处，与RECA所标记的毛细血管的位置无关。而腹腔内小剂量注射LPS却不能激活CNS TLR4介导的固有免疫反应。腹腔内小剂量注射LPS12小时后，扫描新生大鼠全脑各个层面均未发现有EB渗出的迹象，且脑内血管内皮细胞和神经细胞的超微结构都基本正常。第二部分：建立孕期乙醇暴露大鼠模型，3组孕鼠从受孕开始整个孕期分别进食酒精流体饲料，对照组流体饲料和普通固体饲料。从子代大鼠出生后第27天开始对孕期乙醇暴露组与对照组子代大鼠腹腔注射Brdu（200mg/kg），连续注射3天，第四天（生后30天）免疫荧光染色检测大鼠脑内抗Brdu与Doublecortin表达情况。同时给予三组子代大鼠（生后30天）侧脑室立体定位注射LPS（0.3mg/kg,1mg/ml）12小时后Western Blot检测大鼠脑组织中9种蛋白（TLR4, MyD88, TRAF6, TRIF,NF-κBp50, pI-κB, TNFα, IL-1β, IFN）的表达量。为了进一步验证Western Blot的结果，我们做了TRAF6、TRIF分别与NF-κB双标的免疫荧光染色，观察孕期乙醇暴露组与对照组子代大鼠在侧脑室立体定位注射LPS前后这三种分子的表达情况的变化及分布。结果：孕期乙醇暴露组与对照组子代大鼠（生后30天）Doublecortin标记的神经细胞的形态、数量与分布无明显变化，与Brdu双标的新生成的神经细胞的数量与分布也未观察到到明显变化。对照组子代大鼠在LPS刺激12小时后全脑中9种蛋白的表达水平显著上调；而孕期乙醇暴露组子代大鼠在LPS刺激12小时后全脑中TLR4,TRIF和IFN的表达水平与对照组相比降低，MyD88, TRAF6, NF-κBp50, pI-κB, TNFα和IL-1β的表达水平没有显著差异。TLR4，MyD88，TRAF6，pI-κB和NF-κBp50的基础表达量（未给予LPS刺激）在各组子代大鼠间没有显著差异，而TRIF，TNFα，IL-1β和IFN的表达量，孕期乙醇暴露组显著高于对照组。免疫荧光染色结果显示对照组30天子代大鼠侧脑室注射LPS12小时后海马齿状回TRAF6，TRIF和NF-κB的表达水平均显著升高；而孕期乙醇暴露组则没有观察到显著变化。第三部分；分别给予3组子代大鼠（生后30天）侧脑室立体定位注射MyD88抑制肽及其对照肽，12小时后Western Blot检测大鼠全脑中TLR4、NF-κBp50、pI-κB3种蛋白的表达情况。结果：对照组子代大鼠侧脑室注射MyD88抑制肽12小时后TLR4、NF-κBp50、pI-κB的蛋白表达量均显著下调；而孕期乙醇暴露组未见显著差异。总结论：（1）新生大鼠（即使刚出生1天）CNS TLR4介导的固有免疫应答已基本完备，且新生大鼠BBB的结构和功能也已基本完备；（2）孕期乙醇暴露对新生大鼠CNS发育的形态学影响有限；（3）孕期乙醇暴露子代大鼠CNS TLR4介导的固有免疫应答的受到抑制，同时孕期乙醇暴露可使子代大鼠脑内部分炎性因子基础表达量上调，如TRIF，TNFα，IL-1β和IFN；（4）孕期乙醇暴露可影响子代大鼠CNS TLR4介导的固有免疫应答的调节机制。本研究表明孕期乙醇暴露可影响子代大鼠CNS TLR4介导的固有免疫反应。虽然机制尚未明确，但在此基础上的进一步研究定会有助于深入认识孕期乙醇暴露对新生儿CNS发育的影响，并可能找到阻断这种影响的有效途径，减少新生儿CNS出生缺陷的发生率，做到优生优育。甚至还可能为治疗慢性神经、精神性疾病找到新的突破点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R715.3

【相似文献】