高水平胰岛素对早孕小鼠子宫内膜蜕膜化过程中子宫内膜细胞凋亡的调控

发布时间：2019-02-12 21:32

【摘要】：目的:代谢综合征已成为世界范围内的健康问题。以高血糖、肥胖、高血压和胰岛素抵抗为主要特征的代谢综合征及其合并症,对人群健康构成严重威胁。胰岛素抵抗及其相关的代谢综合征与育龄期女性的生殖问题密切相关。在哺乳动物中,子宫内膜蜕膜化是妊娠的一个重要过程。异常的子宫内膜蜕膜化与众多的妊娠异常,如不孕、流产、先兆子痫、胎儿宫内发育迟缓,以及早产密切相关。课题组前期研究发现高水平胰岛素对早孕小鼠子宫内膜蜕膜化有影响,但其机制尚不明确。有研究已经证实胰岛素可通过一系列信号通路调节细胞凋亡,且子宫内膜细胞的凋亡平衡是蜕膜化正常进行的重要保证。因此,本文旨在研究高水平胰岛素对妊娠早期子宫内膜细胞凋亡的影响,并进一步探讨其可能作用机制。方法:1.动物模型的建立及标本收集:购买8周龄昆明鼠饲养,分别皮下注射生理盐水或胰岛素建立正常组和高胰岛素小鼠模型。正常妊娠小鼠模型的建立:将正常组和高胰岛素组雌鼠与正常雄鼠进行交配,次日见阴栓记为正常妊娠第一天,标记为D1,分别测两组正常妊娠第六天(D6)、第七天(D7)、第八天(D8)的尾静脉血血糖,并收集两组孕D6、D7、D8的血清和子宫组织用于后续研究。假孕小鼠模型的建立:将正常组和高胰岛素雌鼠与结扎输精管的雄鼠进行交配,次日见阴栓记为假孕第一天,标记为PD1,分别收集两组假孕第六天(PD6)、假孕第八天(PD8)的子宫组织用于后续研究。人工诱导蜕膜化小鼠模型的建立:正常组与高胰岛素组小鼠假孕第四天(PD4)一侧宫角注射玉米油诱导蜕膜化,对照侧宫角不作处理作为对照,于假孕第八天(PD8)收集人工诱导蜕膜化小鼠的蜕膜侧子宫组织用于后续研究。2.高水平胰岛素对小鼠子宫内膜凋亡的影响:(1)流式细胞术检测正常组与高胰岛素组小鼠孕D6、D7、D8子宫内膜细胞以及人工诱导蜕膜化小鼠子宫蜕膜侧的细胞调亡水平;(2)透射电镜观察正常组与高胰岛素组小鼠孕第八天(D8)子宫内膜的凋亡小体;(3)RT-PCR检测正常组与高胰岛素组小鼠孕D6、D7、D8子宫内膜以及人工诱导蜕膜化小鼠子宫蜕膜侧Bax、Bcl2的表达;(4)免疫组化检测正常组与高胰岛素组小鼠孕D7、D8子宫内膜Bax的表达;(5)Western blot检测正常组与高胰岛素组小鼠孕D6、D7、D8,假孕PD6、PD8和人工诱导蜕膜化小鼠蜕膜侧子宫凋亡相关基因的表达。3.PI3K/Akt信号通路可能参与高水平胰岛素对子宫内膜细胞凋亡的影响:(1)Western blot检测子宫内膜PI3K/Akt信号通路相关蛋白以及凋亡相关蛋白的表达;(2)正常组与高胰岛素组小鼠子宫宫角注射PI3K/Akt信号通路特异抑制剂LY294002后,进一步分析PI3K/Akt信号通路是否参与高水平胰岛素对子宫内膜细胞凋亡的影响。4.原代分离培养小鼠子宫内膜基质细胞并体外诱导蜕膜化:小鼠子宫内膜组织分离提取基质细胞进行培养,免疫荧光检测Vimentin进行基质细胞纯度鉴定。利用雌、孕激素对正常组与高胰岛素组小鼠子宫内膜基质细胞进行体外诱导蜕膜化,RT-PCR检测蜕膜化标志分子dtprp的表达。5.高水平胰岛素对小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后凋亡以及蜕膜化的影响:(1)高胰岛素组和正常组小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后,采用流式细胞术和TUNEL的方法检测细胞的凋亡;(2)JC-1检测小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后细胞色素C的释放;(3)高胰岛素组和正常组小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后,Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达,以及凋亡和蜕膜化相关蛋白的表达;(4)加入PI3K/Akt信号通路特异抑制剂LY294002后,进一步分析PI3K/Akt信号通路是否参与高水平胰岛素对小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后凋亡以及蜕膜化的影响。结果:1.高水平胰岛素小鼠模型的建立:早孕小鼠断颈处死前,尾静脉血测血糖结果显示高胰岛素组小鼠血糖明显升高;ELISA结果显示高胰岛素组孕鼠血清中胰岛素水平明显升高。2.高水平胰岛素对小鼠子宫内膜凋亡的影响:流式细胞术检测结果显示高胰岛素组子宫内膜细胞凋亡水平显著降低;透射电镜结果显示高水平胰岛素组子宫内膜细胞凋亡小体明显减少;Bax的RT-PCR结果和Bax的免疫组化结果一致,显示高胰岛素组子宫内膜Bax表达明显下降;Western blot结果显示高胰岛素组Bax、cleaved-Casepase3、cleaved-PARP表达显著降低而Bcl2表达明显升高。3.PI3K/Akt信号通路可能参与高水平胰岛素对子宫内膜细胞凋亡的影响:Western blot的结果显示在高胰岛素组中,小鼠子宫内膜PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达明显改变。然而,抑制剂LY294002能够显著恢复高水平胰岛素对早孕小鼠子宫内膜细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响。4.高水平胰岛素对小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后凋亡的影响:高胰岛素组和正常组小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后,流式细胞术、TUNEL、JC-1以及Western blot检测结果显示高胰岛素组凋亡水平显著降低。然而,抑制剂LY294002能够改善高水平胰岛素对原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后凋亡的影响。5.高水平胰岛素对小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化的影响:RT-PCR结果显示在小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型中,高胰岛素组蜕膜化相关因子dtptp表达明显降低。同时,Western blot的结果显示蜕膜化相关蛋白在高胰岛素组中受到明显抑制,表明高胰岛素组子宫内膜基质细胞体外蜕膜化受到显著影响。然而,抑制剂LY294002能够显著改善高水平胰岛素对原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化后的影响。结论:研究表明高水平胰岛素可能打破子宫内膜细胞凋亡的平衡进而影响子宫内膜蜕膜化,PI3K/Akt信号通路可能参与其中。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R714.2

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本文编号：2420812