体内外成熟卵丘—卵母细胞复合体中卵丘细胞蛋白质组学差异的研究

发布时间：2019-03-17 21:26

【摘要】：目前体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET)周期成熟卵母细胞的获得主要有两种方式：体内成熟和体外成熟。卵母细胞体外成熟(in vitro maturation，，IVM)是指通过体外培养,使卵泡内的未成熟卵母细胞发育成为成熟的第二次减数分裂中期(metaphasell, MⅡ)卵母细胞。IVM是一项新的辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART),在ART中发挥极其重要的作用。与传统经典的IVF相比,IVM技术具有的优点是减少大量促排卵药诱发的卵巢过度刺激综合征(OHSS)；缩短治疗周期；降低使用外源性促性腺激素的费用；与IVF联合应用,可以增加可移植胚胎和冷冻胚胎的数量,增加累积妊娠率,提高患者助孕成功率。在动物研究方面,IVM成功率相当高,被广泛应用,是人工养殖、胚胎干细胞技术、克隆和转基因动物的重要技术平台。然而,人类IVM仍存在诸多问题：卵母细胞的体外成熟率不高、成熟后卵母细胞的体外受精率和卵裂率较低、胚胎移植后妊娠率较低。自从1991年Cha等报道首例IVM妊娠以来,IVM一直进展缓慢。IVM低成熟率、受精率、妊娠率的关键因素是卵母细胞质量差,胚胎发育不良。卵母细胞质量是女性生殖的关键因素,成熟卵母细胞的生化和分子状态允许卵母细胞受精和发育成胚胎,移植后能健康发育到足月。差的卵母细胞质量导致多精受精或胚胎发育停滞或自然流产。目前研究发现体外培养卵母细胞核成熟几乎不受影响,其胞质成熟不完全可能是其发育能力下降的重要原因。卵泡发育过程中,卵母细胞与卵丘细胞通过缝隙连接和旁分泌方式形成一个很重要的双向调节轴,卵母细胞起主导作用,在卵母细胞生长发育中所释放的分泌因子、生长因子等调控卵丘细胞的分化和功能,反过来卵丘细胞又控制卵母细胞生长环境,影响卵母细胞的发育。卵母细胞与卵丘细胞的这种相互作用使得两者共同发育生长,最终促进了卵母细胞的成熟。卵丘细胞在卵母细胞成熟特别是胞质成熟过程中起重要作用,体外培养中,卵母细胞与卵丘细胞之间信息传递减弱以及细胞生长环境改变引起的应激反应,可能导致卵丘细胞功能改变,进而影响卵母细胞发育。所以,对卵丘细胞功能的研究可能是探讨卵母细胞体外成熟的一条新思路。目前对于IVM卵丘细胞的研究主要集中于-些特定蛋白,未能从整体上系统地分析卵丘细胞的蛋白质群及其作用。因此,本实验通过研究体外与体内成熟卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)中卵丘细胞的蛋白质表达的差异,寻找与体外卵母细胞成熟相关的重要蛋白质群,利用卵丘细胞蛋白质组学的研究确定人卵丘细胞不同分子与卵母细胞发育能力的相关性,为预测卵母细胞发育能力确定新的可靠标志物。第一部分体内外成熟卵丘-卵母细胞复合体(COCs)中卵丘细胞蛋白质组的差异表达分析目的：比较体外培养成熟与体内成熟COCs中卵丘细胞的蛋白质表达的差异,寻找与卵母细胞体外成熟相关的重要蛋白质群。方法： 1、研究对象选择2012年4-10月在深圳市妇幼保健院生殖中心单纯因男性因素行卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)治疗的患者20例。 2、标本收集及分组20例患者进行常规长方案降调和超排卵,3个以上卵泡平均直径达到16mm,注射HCG,34-36小时内取卵。取卵后,在体视显微镜下将卵冠丘复合体分级：卵冠丘复合体大而松散,放射冠界限清楚者为成熟COCs:卵冠丘复合体小而致密,放射冠紧包绕在透明带周围者为不成熟COCs。(1)体内成熟卵丘细胞的收集：将成熟的COCs孵育4h,ICSI之前,用巴士德吸管吹散COCs周围的卵丘细胞,拆除卵丘细胞后的卵母细胞在倒置显微镜下观察其成熟度,收集成熟卵母细胞周围的卵丘细胞,标为对照组。(2)体外成熟卵丘细胞的收集：将不成熟COCs置于添加了0.075IU/ml HMG的成熟培养液中,于37-C,5%C02,95%湿度培养箱中培养,24-36h后用注射针剥除卵丘细胞,观察卵母细胞是否排出第一极体,收集排出第一极体卵母细胞周围的卵丘细胞,标为实验组。 3、实验方法将收集到的两组卵丘细胞进行双向凝胶电泳,用ImageMaster2D platinum5.0软件对凝胶图像进行分析找出差异蛋白质点,并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)进行肽指纹图谱鉴定,通过Mascot软件进行数据库搜索,鉴定出具体的差异蛋白质。结果： 1、在20例患者中,共获取116个未成熟卵,平均每患者获得5.8个,经24-36小时体外培养后,成熟85个,体外成熟率为73.28%(85/116)。 2、双向凝胶电泳结果双向凝胶电泳所得到的图谱,经ImageMaster2D platinum5.0软件分析后,共找到23个差异蛋白质点。实验组与对照组相比,共有13个蛋白质表达上调(其中7个蛋白质的表达水平在实验组是对照组的3倍以上；6个蛋白质在实验组有表达,而在对照组中无表达),10个蛋白质表达下调(其中2个蛋白质的表达水平,实验组比对照组降低3倍以上；8个蛋白质在实验组无表达,在对照组中有表达)。 3、差异蛋白质质谱鉴定结果根据蛋白质的分子量、等电点及差异倍数≥3倍等综合条件,选择10个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,通过Mascot查询软件及搜索NCBInr数据库,结果PRO2044蛋白(ALB)、KIAA1191蛋白(KIAA1191)、乙酰辅酶A酰基转移酶2蛋白(ACAA2)、Ⅱ型角蛋白(KRT2)和ARID2蛋白(ARID2)共五种蛋白质被确定为差异表达蛋白质。结论： 1、来自于超排卵周期中的未成熟卵母细胞具有在体外成熟的能力。 2、通过蛋白质组学研究技术发现卵丘-卵母细胞复合体在体内成熟与体外成熟存在蛋白质表达差异,这些差异表达蛋白质与清除自由基、抗凋亡、细胞周期调控等生物功能相关,这些蛋白质的表达异常可能是体外成熟卵母细胞质量差的原因之一第二部分应用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析卵丘细胞差异蛋白表达与卵母细胞及胚胎发育之间的关系目的：观察筛选出的差异蛋白在体内成熟卵丘细胞中的表达与卵母细胞及其后续胚胎发育能力的关系,探讨新的预测卵母细胞发育能力的标志物。方法： 1、研究对象选择2012年11月～2013年4月在深圳市妇幼保健院生殖中心单纯因男性因素行ICSI-ET治疗的患者20例。 2、标本收集体内成熟卵丘细胞的收集方法同第一部分。 3、实验方法 3.1实时荧光定量PCR检测：应用RT-qPCR技术检测第一部分研究鉴定出的五种差异蛋白(ALB、KIAA1191、ACAA2、KRT2和ARID2) mRNA在收集到的每例患者卵丘细胞的表达水平。采用Trizol法提取每例患者卵丘细胞的总RNA,并测量其RNA浓度及纯度,A260/A280比值在1.8～2.0范围。将mRNA逆转录成cDNA,用ABI7300型实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增,计算出五种蛋白nRNA的表达水平。 3.2卵母细胞及后续胚胎发育能力的观察：卵母细胞及后续胚胎发育能力用受精率、卵裂率、优质胚胎形成率和胚胎种植率评价。 4、统计学分析采用SPSS13.0软件统计学分析,mRNA表达水平用均数±标准差(x±s)表示。计量资料采用检验；正态分布的双变量资料,采用Pearon相关分析,非正态分布,用Spearman相关分析。P0.05为差异有统计学意义。结果： 1、RT-qPCR相对定量结果卵丘细胞上五种蛋白nRNA均有表达。所有的溶解曲线峰均为特异的单峰,熔点温度(波峰对应的温度)均在82℃以上,表明五种目的基因和内参基因p-actin的扩增产物均有特异性。ALBmRNA、KIAA1191mRNA、ACAA2mRNA、 KRT2mRNA和ARID2mRNA的相对表达量分别为1.8474±1.1825、1.2122±0.8379、1.3388±1.6907、1.0810±0.6026、1.4712±0.8401。 2、五种蛋白nRNA表达量与受精率、卵裂率、优胚率及种植率的相关性 ACAA2mRNA和ARID2mRNA相对表达量与优胚率呈正相关(r=0.471,P=0.036;r=0.849,P=0.000),与受精率、卵裂率和种植率无明显相关性((r=0.081,P=0.736; r=-0.075, P=0.754; r=0.283, P=0.240; r=0.194, P=0.413; r=0.184, P=0.436; r=0.201, P=0.394); ALBmRNA、KIAA1191mRNA和KRT2mRNA相对表达量与受精率、卵裂率、优胚率和种植率均无明显相关性；五种蛋白mRNA表达量与获卵数、患者不孕年限、使用促性腺激素天数和总剂量、基础性激素水平等均无相关性。 3、妊娠组与未妊娠组五种蛋白mRNA相对表达量的比较妊娠组与未妊娠组比较,卵丘细胞五种蛋白mRNA的相对表达量无显著性差异(P=0.091、0.399、0.411、0.266和0.293)。 4、卵丘细胞五种蛋白nRNA之间表达量的相关性 ARID2mRNA与ACAA2mRNA表达量呈显著正相关(r=0.504,P=0.024),其余表达量之间无明显相关性。结论： 1、五种差异蛋白质mRNA,即ALB、KIAA1191、ACAA2、KRT2和ARID2mRNA在体内成熟卵丘细胞上均有表达,其中ARID2mRNA与ACAA2mRNA表达量呈显著正相关。 2、ACAA2mRNA和ARID2mRNA相对表达量与优质胚胎率呈显著正相关。 3、ACAA2mRNA及ARID2mRNA在体内成熟卵丘细胞上表达,而其蛋白在体外成熟卵丘细胞未表达,可能是体外成熟卵母细胞发育能力差的重要因素。 4、卵丘细ACAA2mRNA和ARID2mRNA定量检测可以作为一种无创、定量的方法预测胚胎发育潜能,是胚胎质量的预测标志物。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R714.8

【参考文献】