靶向IGF-1R、HPV18-E6基因的短发卡RNA对宫颈癌Hela细胞体内外生长的实验研究

发布时间：2019-04-22 18:32

【摘要】：目的：宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，其发病率已超过结直肠癌，仅次于乳腺癌，且近年来有逐渐上升趋势[1]。手术、放化疗等传统治疗未取得满意成效。随着RNA干扰技术发展，肿瘤的基因治疗展现出美好前景。胰岛素样生长因子系统（IGFs）与肿瘤的关系也是近年研究的热点，IGF-1R通过促进正常细胞向恶性表型转化，促进肿瘤细胞生长和分裂增殖，抑制肿瘤细胞凋亡。我们前期研究表明RNAi沉默IGF-1R基因能明显抑制基因IGF-1R的表达，从而促进Hela细胞凋亡。高危型HPV16/18的E6基因是引起宫颈癌的主要致癌基因之一，有研究表明HPVE6-siRNA转染HPV阳性的宫颈癌细胞能够降低细胞内E6基因的表达，抑制细胞增殖[2-3]。然而人类肿瘤的发生发展是一个多基因多步骤多因素的过程，单独干扰某一个基因在肿瘤的基因治疗进程中存在局限性，因此利用RNAi技术同时抑制相关多个基因或同一个基因多个靶点已被受众多研究者关注[4-5]。在此研究基础上，我们构建了一个同时编码IGF-1R和HPV18-E6两个不同基因的shRNA质粒表达载体，并与干扰单个基因进行比较，研究多基因共同沉默在肿瘤治疗方面的作用，同时将RNA干扰与化疗药物顺铂联合，观察能否增强宫颈癌Hela对化疗药物顺铂的敏感性，探讨提高宫颈癌治疗效果的可能方法。方法：1. shRNA质粒构建①根据IGF-1R、HPV18-E6的cDNA序列分别设计构建IGF-1R shRNA重组质粒pGenesil1.1-IGF-1R， HPV18-E6shRNA重组质粒pGenesil1.2-HPV18-E6及阴性对照重组质粒pGenesil1.1-HK。②利用分子亚克隆技术，，由IGF-1R、HPV18-E6重组质粒构建双基因串联的shRNA质粒重组表达载体pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)。2.体外实验研究①实验分为五组：IGF-1R组，转染重组质粒pGenesil1.1-IGF-1R；E6组，转染重组质粒pGenesil1.2-HPV18-E6；IGF-1R+E6组，转染重组质粒pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)；NC组，转染阴性对照质粒pGenesil1.1-HK；Blank组，未转染空白对照组，分别进行体内外实验。②瞬时转染24h、48h、72h时，RT-PCR测定各组IGF-1R和HPV18-E6mRNA表达。③Hoechst33258染色检测瞬时转染48h时各组细胞凋亡情况。④G418筛选获得稳定转染Hela细胞，RT-PCR测定稳定转染IGF-1R、HPV18-E6mRNA表达。⑤Western-blotting检测稳定转染细胞IGF-1R和HPV18-E6蛋白表达。⑥MTT检测各稳定转染组细胞增殖能力及对顺铂刺激的敏感性。3.体内实验研究①稳定转染Hela细胞接种BALB/c裸鼠，观测各组成瘤时间、瘤体积和瘤重量的变化。②应用免疫组化测定IGF-1R、HPV18-E6和CD34蛋白表达。③分别利用ELISA法检测各组BALB/c裸鼠血清中宫颈癌肿瘤标记物, SCC-Ag和TPS的含量，生化法检测TSGF的含量。结果：1.shRNA构建成功①酶切和测序结果表明成功构建shRNA重组质粒表达载体pGenesil1.1-IGF-1R、pGenesil1.2-HPV18-E6和pGenesil1.1-HK。②酶切鉴定结果显示双基因shRNA串联质粒表达载体pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)构建成功；2.体外研究①各重组质粒表达载体转染Hela细胞，瞬时转染24h、48h、72h RT-PCR结果显示：三个时间点单独沉默或共沉默组均能有效抑制相应基因mRNA表达，联合沉默组在瞬时转染48h对IGF-1R mRNA和HPV18-E6mRNA表达抑制率分别为63.01％和78.46％，均显著高于转染单基因shRNA的IGF-1R组和E6组（P0.05）。②Hoechest33258染色检测，IGF-1R+E6组的凋亡率(32.81±1.07)%显著高于IGF-1R组(21.65±0.34)%（P0.05）和E6组(19.73±1.62)%（P0.05）。③G418成功筛选各重组质粒稳定转染的Hela细胞，FCM检测各组转染效率均达80%以上；RT-PCR显示稳定转染IGF-1R+E6组对Hela细胞IGF-1R和HPV18-E6mRNA表达的抑制率分别为71.30%和78.52%。④Western-blotting检测结果显示IGF-1R+E6组对HPV18-E6蛋白和IGF-1R蛋白表达的抑制率分别为67.88%和81.14%，均有统计学意义（P0.01）。⑤MTT检测提示：与IGF-1R和E6组比较，IGF-1R+E6组稳定转染细胞的增殖能力明显抑制，对顺铂刺激的敏感性显著提高（P0.05）。3.体内研究①体内实验结果显示IGF-1R+E6组移植瘤较单基因沉默组的平均瘤体积、重量明显下降（P0.05）。②切片的免疫组化结果进一步证实IGF-1R+E6组Hela细胞IGF-1R、HPV18-E6两种蛋白及CD34表达均明显下调。③ELISA法检测结果显示IGF-1R+E6组裸鼠血清中TPS表达明显降低。结论：shRNA串联重组质粒表达载体pGenesil1.1+2-(IGF-1R+HPV18-E6)转染人宫颈癌Hela细胞后，可同时降低IGF-1R和HPV18-E6mRNA与蛋白表达，比单独沉默IGF-1R或HPV18-E6基因能较好地促进Hela细胞凋亡、抑制细胞增殖和提高化疗药物的敏感性。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.33

【参考文献】