PARP-1对卵巢癌血管生成、增殖的影响及其机制探讨

发布时间：2019-05-09 11:04

【摘要】：背景和目的卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤,具有高度侵袭性,且发病隐匿,超过70%的患者就诊时已为晚期,预后差。肿瘤细胞减灭术辅以铂类和紫杉醇为主的化疗是目前卵巢癌的一线治疗方案,但是化疗耐药及肿瘤复发使传统治疗面临着严峻挑战。因此,卵巢癌的分子靶向治疗是近年来国内外研究的热点。目前分子靶向制剂大多是与肿瘤异常靶分子结合的单克隆抗体或小分子蛋白激酶抑制剂,从而调节细胞生长、抑制血管生成等,特异性高且毒性小。 PARP-1是存在于多数真核细胞内、具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基(PAR)催化活性的蛋白酶,在DNA损伤修复、基因转录、细胞周期、染色体功能、基因组稳定和细胞死亡等方面均发挥重要作用。本课题前期研究表明,PARP-1在卵巢癌中的表达明显上调,应用PARP-1抑制剂可增强卵巢癌耐药细胞对化疗药物的敏感性。Pyriochou等研究证实,PARP-1抑制剂PJ34可抑制鸡胚尿囊膜实验(CAM)的血管生成,有关PARP-1是否对卵巢癌的血管生成产生影响的报道较少。本研究拟采用免疫组织化学方法检测PARP-1、VEGF-A. MVD在上皮性卵巢癌中的表达,分析PARP-1与VEGF-A、MVD表达的相关性,并通过RNA干扰沉默SKOV3细胞的PARP-1基因,检测转染后细胞VEGF-A的表达变化以及对脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外成管能力的影响,探讨PARP-1对卵巢癌血管生成、增殖的影响,从而为PARP-1的分子靶向治疗提供理论依据。方法 1.采用免疫组织化学方法检测60例上皮性卵巢癌原发灶中PARP-1、VEGF-A、MVD的表达及30例正常卵巢对照组织中PARP-1的表达,根据组化结果判定标准将卵巢癌组织分为PARP-1阳性组、PARP-1阴性组。 2.RNA干扰沉默卵巢癌SKOV3细胞的PARP-1基因,将细胞分为转染阴性对照siRNA组(NC-siRNA组)、转染PARP-1siRNA组(PARP1-siRNA组)。 3.体外成管实验观察沉默PARP-1对脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外成管能力的影响。 4.MTT法检测NC-siRNA组、PARP1-siRNA组细胞的增殖活性。 5.实时定量PCR (qRT-RCR)检测PARP-1及VEGF-A mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞内PARP-1及VEGF-A蛋白表达。ELISA法检测细胞上清中VEGF-A的含量。结果 1. PARP-1、VEGF-A、MVD在上皮性卵巢癌中的表达PARP-1阳性表达主要定位于细胞核,卵巢癌组织中PARP-1阳性率为73.3%(44/60),正常卵巢对照组织中PARP-1阳性率为26.7%(8/30),差异有统计学意义(P0.05). VEGF-A阳性表达主要定位于细胞浆,在所有检测的卵巢癌标本中全部表达,评分位于1-6分,均值为(3.05±1.61)分。CD34标记的MVD显示,所有卵巢癌标本的MVD均值为19.14±6.24。 2. PARP-1与卵巢癌临床病理特征之间的关系PARP-1在肿块＜2cm组的阳性率显著低于肿块＞2cm组(P0.05),在高中分化组的阳性率显著低于低分化组(P0.05),在淋巴结转移组的阳性率显著高于无淋巴结转移组(P0.05),而在不同临床分期组间的表达差异无统计学意义(P0.05)。 3.上皮性卵巢癌中PARP-1与VEGF-A、MVD的相关性VEGF-A评分均值PARP-1阳性组(3.80±1.69)高于PARP-1阴性组(2.30±1.16),两组差异具有统计学意义(P0.05)。MVD均值PARP-1阳性组(23.86±4.67)高于PARP-1阴性组(14.43±3.26),差异具有统计学意义(P0.01)。 4.转染效率检测慢病毒载体中携带绿色荧光蛋白GFP,在倒置荧光显微镜下,成功转染细胞发绿色荧光,转染12h后可见荧光表达,72h荧光强度最高,NC-siRNA组、PARP1-siRNA组的转染效率分别为89%、86%。 5.RNA干扰对HUVEC体外成管的影响提取转染后两组细胞的上清液分别培养HUVEC,结果显示,体外成管数目NC-siRNA组(14.67±1.21)高于PARP1-siRNA组(8.83±1.47),差异有统计学意义(P0.01)。 6.RNA干扰对细胞增殖的影响MTT检测结果表明,PARP1-siRNA组细胞增殖活性减弱,在48h、72h、96h,与NC-siRNA组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。 7.RNA干扰对PARP-1mRNA及蛋白的抑制作用与NC-siRNA组相比,PARP1-siRNA组PARP-1mRNA的相对表达量明显下降(P0.05),以actin为内参照,NC-siRNA组、PARP1-siRNA组PARP-1蛋白表达量分别为0.93±0.22、0.38±0.05,差异有统计学意义(P0.05)。表明成功构建了PARP-1基因沉默的细胞模型。 8.RNA干扰对VEGF-A mRNA及蛋白表达的影响PARP-1基因被沉默后,PARP1-siRNA组VEGF-A mRNA水平较NC-siRNA组明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示,NC-siRNA组、PARP1-siRNA组VEGF-A蛋白表达量分别为：0.90±0.18、0.41±0.08,PARP1-siRNA组较NC-siRNA组表达下降(P0.05)。表明siRNA沉默PARP-1基因后,VEGF-A在转录和翻译水平均下调。 9. ELASA检测细胞上清中VEGF-A含量细胞上清中VEGF-A均值：NC-siRNA组(447.22±188.52) pg/mL高于PARP1-siRNA组(248.12±82.74)pg/mL(P0.05)。结论 1. PARP-1通过上调VEGF-A的表达促进卵巢癌的血管生成。 2.沉默PARP-1可抑制SKOV3细胞的增殖能力。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】