牛磺酸对宫颈癌细胞自噬与凋亡的影响

发布时间：2019-05-22 07:38

【摘要】：目的:1.观察牛磺酸对人宫颈癌细胞凋亡的影响及其初步机制。2.观察牛磺酸对人宫颈癌细胞自噬的影响及其初步机制。方法:1.MTT法检测Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 mM,320 mM)分别处理宫颈癌细胞系HeLa及SiHa 24 h,48 h,72 h后对细胞存活率的影响,以明确其剂量-效应关系。2.采用Western blotting法检测Tau(0 mM,20 mM,40 m M,80 mM,160 mM)及CQ 20μM分别处理宫颈癌细胞系HeLa和SiHa 48 h后,凋亡相关蛋白MST1、Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白LC3-II,LC3-I,Beclin1变化,评价Tau对凋亡和自噬的影响。3.采用RT-qPCR检测Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 m M)及CQ 20μM分别处理宫颈癌细胞系HeLa和SiHa 48 h后,MST1,Bax,Bcl-2,Caspase-3凋亡相关mRNA及AKT,Beclin1自噬相关mRNA的表达水平,评价Tau对凋亡和自噬的影响。4.收集细胞并用PBS冲洗,采用Annexin V-FITC/PI双染色细胞凋亡检测试剂盒检测Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80 mM,160 m M),CQ 20μM及高表达MST1基因对SiHa细胞凋亡的影响。5.用Tau(0 mM,40 mM)处理对数生长期HeLa细胞48 h后,单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色观察自噬泡的形成。6.将GFP-RFP-LC3质粒转染HeLa和SiHa细胞,用荧光显微镜观察Tau(0 mM,20 mM,40 mM,80m M,160 mM),CQ 20μM处理48 h后细胞内绿色荧光斑点和红色荧光斑点的聚集情况检测自噬水平。结果:1.MTT法显示Tau对人宫颈癌细胞系HeLa和SiHa具有增殖抑制作用,并呈时间-剂量依赖性,Tau对人宫颈癌细胞系HeLa和SiHa增殖抑制作用明显增加(P0.01)。计算Tau作用人宫颈癌细胞系HeLa和SiHa后的IC50值发现,Tau对HeLa细胞的增殖抑制能力大于SiHa细胞。2.Western Blot显示在HeLa细胞中,Tau 40 mM组相对其它浓度组能够显著升高MST1蛋白表达(P0.01),在SiHa细胞中,MST1蛋白表达随着Tau浓度逐渐升高而升高。2种细胞的Bcl-2蛋白表达均随着Tau浓度逐渐升高而降低(P0.01),Bax蛋白表达均随着Tau浓度逐渐升高而升高(P0.05)。而对自噬标志性蛋白LC3和Beclin1的表达情况,2种细胞Beclin1蛋白表达均随着Tau浓度逐渐升高而降低(P0.01),胞浆型LC3(即LC3-I)转变为自噬体膜型LC3(即LC3-II)随着Tau浓度逐渐升高而减少,LC3-II\LC3-I比值减少(P0.01)。3.RT-qPCR显示在HeLa和SiHa细胞中,Bax和MST1的表达显著上调(P0.01),Caspase-3稍有上调(P0.05),Bcl-2的表达显著下调(P0.01),AKT的表达显著上调(P0.01),Beclin1的表达显著下调(P0.01),差异均有统计学意义。4.高浓度Tau诱导凋亡SiHa细胞凋亡。体外介导p-EGFP-MST1质粒转入SiHa细胞凋亡率升高,与牛磺酸(160 mM)联合处理时,细胞凋亡率的升高更明显(P0.01)5.MDC可被细胞吸收并选择性地结合到自噬囊泡膜上,使自噬泡在荧光显微镜下呈现为黄绿色或深绿色点状结构。Tau 40 mM MDC阳性细胞的荧光强度及细胞内MDC荧光颗粒数目较Control组明显减少,提示Tau能抑制HeLa和SiHa细胞自噬。6.在HeLa和SiHa细胞中Tau处理组较Control组、CQ 20μM组绿色荧光斑点和红色荧光斑点的数量明显减少,提示Tau能抑制HeLa和SiHa细胞自噬。结论:1.Tau能抑制人宫颈癌HeLa和Si Ha细胞的增殖,并呈现浓度和时间依赖性。2.Tau能促进人宫颈癌HeLa和SiHa细胞凋亡,其作用机制是通过上调MST1、Bax蛋白表达和下调Bcl-2蛋白表达实现的。.3.Tau能抑制人宫颈癌HeLa和SiHa细胞自噬,Tau抑制人宫颈癌细胞自噬的机制是通过下调Beclin1蛋白表达及LC3-II\LC3-I比值及上调AKT表达实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

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本文编号：2482780