甲状腺功能减退对妊娠期大鼠下丘脑—垂体—卵巢轴及生殖功能的影响

发布时间：2019-06-04 16:19

【摘要】：促性腺激素释放激素(GnRH)是下丘脑-垂体-性腺轴生殖激素级联释放的重要调节物。Gn RH与妊娠识别、胚胎附植、妊娠维持及终止等有着直接或间接的联系,是下丘脑-垂体-性腺轴的至关重要的促垂体激素。临床发现,甲状腺素与下丘脑-垂体-性腺轴之间存在调节关容摘要系,但是确切的机制不清。通过检测甲状腺功能减退状况下,大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴激素水平变化,观察雌性成年大鼠受孕率、流产率的差异,以及运用免疫组织化学及实时定量PCR测定方法对各组大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴中的Gn RH表达、Gn RH受体在下丘脑、垂体、卵巢的分布,了解Gn RH是否为甲状腺激素调节下丘脑-垂体-卵巢轴及生殖功能的核心环节。为将来甲状腺激素与性腺激素的相互调节机制研究打下基础。材料与方法甲减及妊娠大鼠动物模型的建立实验步骤:106只雌性SD大鼠,随机分为2组,正常饮用水组(n=30)及0.05%丙基硫氧嘧啶(PTU)饮用水组(n=76),诱导成年期甲状腺功能减退症大鼠模型6周。随机从两组中抽取5只,测定甲状腺激素,判定甲减造模是否成功。造模成功后,进一步从正常饮用水组随机选取5只作为正常组(NG,n=5),PTU饮用水组中随机选取5只作为甲减组(HG,n=5),剩余正常饮用水组中25只作为正常合笼组(n=25)及PTU饮用水组中71只作为甲减合笼组(n=71)通过雌雄2:1合笼建立妊娠模型,妊娠后分别归为正常妊娠组(n=10)和甲减妊娠组(n=28)。没有妊娠就归为正常对照组和甲减组,最终单纯甲减组43只,正常对照25只。标本制备禁食12h,腹腔麻醉,腹主动脉取血,留取脑组织、垂体、卵巢组织,其中一部分置冻存管中,立即放入液氮中,冷却后置-80℃冰箱保存,用于实时定量PCR检测。一部分组织使用10%甲醛液中固定,然后经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切片免疫组织化学将石蜡包埋的组织标本制成3~4um厚度的切片,常规采用二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水。置于微波炉调到中高火加热至沸腾,冷却15min后,再煮沸一次冷却后即可完成抗原修复。0.3%的过氧化氢溶液处理30min以封闭内源性过氧化物酶;1%正常兔血清封闭切片1h。滴加一抗(兔抗Gn RH多克隆抗体,)/兔抗TSHR多克隆抗体,加广谱生物素标记的二抗,加链霉素一生物素-过氧化物酶复合物,DAB显色,苏木精轻度复染,中性树胶封片。引物设计和反应条件根据Genbank序列,使用Primer Premier5.0软件设计引物,由大连Ta Ka Ra公司合成引物。引物序列见正文。RNA的提取及mRNA的合成按试剂盒说明书,使用Trizol(Invitrogen(英杰生命科技有限公司)从组织中提取RNA。使用逆转录试剂盒(Invitrogen(英杰生命科技有限公司)合成m RNA。Real-time PCR分析使用Trizol从组织中提取RNA。按照试剂盒说明书步骤,分别加入引物及i Taq Universal SYBR Green master mix(Tli RNase H Plus)(宝生物工程大连有限公司),使用Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System(Thermo Fisher,Singapore)检测m RNA的表达水平。基因表达量用2~(-ΔΔCt)相对量表示。目的基因表达水平以β-actin作为内参进行标准化,结果以RQ值等来体现。ELISA法测定血清T3 T4 TSH按照药盒说明书(上海源叶生物技术有限公司)采用ELISA法测定T3 T4 TSH。统计学处理采用SPSS16.0软件进行分析,正态分布计量资料数据以sx±描述,偏态分布定量数据用M(P25,P75)表示,符合正态分布多组定量数据间差异比较采用单因素方差分析(One-way analysis of variance,One-way ANOVA),多组之间两两比较采用SNK-Q检验的方法,P0.05时差异有统计学意义不满足正态分布的多组之间的比较采用Kruskal-Wallis检验,多组之间两两比较采用P值修正的方法。两组和多组定性数据之间的比较采用卡方检验的方法。结果:⑴4组间下丘脑GnRH mRNA RQ值:通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=1.412,P=0.296)⑵4组间垂体GnRH mRNA RQ值:差异无统计学意义(F=1.153,P=0.368)⑶4组间卵巢GnRH mRNA RQ值:差异无统计学意义(c=1.276,P=0.077)⑷4组间下丘脑TSH mRNA RQ值:通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.658,P=0.596)⑸4组间垂体TSH mRNA RQ值:通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=1.305,P=0.318)⑹4组间卵巢TSH mRNA RQ值:通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.281,P=0.838)⑺正常组下丘脑、垂体、卵巢GnRH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(c2=7.372,P=0.025);卵巢与垂体GnRH mRNA RQ值比较,差异无统计学意义(Z=0.889,P=0.374);卵巢与下丘脑GnRH mRNARQ值比较,差异有统计学意义(Z=2.666,P=0.008);垂体与下丘脑GnRH mRNA RQ值比较,差异无统计学意义(Z=1.778,P=0.075)⑻甲减组下丘脑、垂体、卵巢GnRH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(标准c2=8.769,P=0.012);卵巢与垂体GnRH mRNA RQ值比较,差异无统计学意义(Z=1.177,P=0.239);卵巢与下丘脑GnRH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(Z=2.942,P=0.003);垂体与下丘脑GnRH mRNA RQ值比较,差异无统计学意义(Z=1.765,P=0.078)⑼正常妊娠组下丘脑、垂体、卵巢GnRH mRNA RQ值比较:差异有统计学意义(标准c2=6.144,P=0.046);卵巢与下丘脑GnRH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(Z=2.204,P=0.028);卵巢与垂体GnRH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(Z=2.205,P=0.043);垂体与下丘脑GnRH mRNA RQ值比较,差异无统计学意义(Z=0.329,P=0.742)⑽甲减妊娠组下丘脑、垂体、卵巢GnRH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(标准c2=8.909,P=0.012);卵巢与垂体GnRH mRNA RQ值比较,差异无统计学意义(Z=1.706,P=0.088);卵巢与下丘脑GnRH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(Z=2.961,P=0.003);垂体与下丘脑GnRH mRNA RQ值比较,差异无统计学意义(Z=1.382,P=0.167)⑾正常组下丘脑、垂体、卵巢TSH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(F=7.276,P=0.013);卵巢与垂体TSH mRNA RQ值比较:通过单因素方差分析,差异无统计学意义(P=1.000);卵巢与下丘脑TSH mRNA RQ值比较,差异有统计学意义(P=0.030);垂体与下丘脑TSH mRNA RQ值比较:通过单因素方差分析,差异有统计学意义(P=0.026)⑿甲减组下丘脑、垂体、卵巢TSH mRNA RQ值比较,通过Kruskal-Wallis检验差异无统计学意义(X~2=2.577,P=0.276)⒀正常妊娠组下丘脑、垂体、卵巢TSH mRNA RQ值比较:差异无统计学意义(Z=0.894,P=0.640)⒁甲减妊娠组下丘脑、垂体、卵巢TSH m RNA RQ值比较,差异无统计学意义(F=1.907,P=0.210)⒂下丘脑GnRHR表达:ar核团在4个组中,通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.373,P=0.774);vmh核团在4个组中,通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=1.346,P=0.291);ah核团在4个组中,通过Kruskal-Wallis检验,差异无统计学意义(标准c2=2.486,P=0.478);pa核团在4个组中,通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.591,P=0.670);pmv核团在4个组中,通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.517,P=0.676);甲减妊娠组中,通过单因素方差分析,5个核团差异无统计学意义(F=0.440,P=0.779);甲减组中,通过Kruskal-Wallis检验,5个大脑核团之间的差异无统计学意义(标准c2=0.717,P=0.949);正常组中,通过单因素方差分析,5个核团差异无统计学意义(F=0.810,P=0.531);正常妊娠组中,通过单因素方差分析,5个核团差异无统计学意义(F=0.432,P=0.782)⒃垂体GnRHR表达:通过Kruskal-Wallis检验,4个组间积分光密度差异有统计学意义(P=0.0.37);通过Nemenyi检验,甲减妊娠组与甲减组差异无统计学意义(标准X~2=0.089,P=0.929),甲减妊娠组与正常组差异有统计学意义(标准X~2=1.809,P=0.071),甲减妊娠组与正常妊娠组差异有统计学意义(标准X~2=2.345,P=0.019),甲减组与正常组差异无统计学意义(标准X~2=1.720,P=0.086),甲减组与正常妊娠组差异有统计学意义(标准X~2=2.268,P=0.023),正常组与正常妊娠组差异无统计学意义(标准X~2=0.779,P=0.436)⒄卵巢GnRHR表达:通过单因素方差分析,4个组间差异无统计学意义(F=0.544,P=0.655)⒅下丘脑TSHR表达:ar核团在4个组中,通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.753,P=0.536);vmh核团在4个组中,通过Kruskal-Wallis检验,差异无统计学意义(标准c2=5.795,P=0.122);ah核团在4个组中,通过Kruskal-Wallis检验,差异无统计学意义(标准c2=4.953,P=0.175);pa核团在4个组中,通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.972,P=0.430);pmv核团在4个组中,通过单因素方差分析,差异无统计学意义(F=1.100,P=0.378)⒆垂体、卵巢TSHR表达:通过单因素方差分析,4个组间差异无统计学意义(F=1.721,P=0.240);卵巢TSHR(光密度);通过单因素方差分析,4个组间差异无统计学意义(F=1.608,P=0.199)。⒇正常合笼组与甲减合笼组相比,受孕率未见明显差异(P0.05);甲减妊娠组与正常妊娠组相比,流产率增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.GnRHR在妊娠期大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴组织中均有表达,表明GnRH在该性腺轴中除了参与卵巢产生的激素对垂体促性腺激素及下丘脑GnRH分泌的长反馈和调节垂体激素(LH和FSH)与下丘脑激素的短反馈外,下丘脑、垂体、卵巢内源性Gn RH可能通过自分泌和旁分泌方式参与大鼠妊娠期的维持。2.在下丘脑各核团中,GnRHR分布无明显差异,推测下丘脑GnRH神经元可能对维持大鼠妊娠不起主导作用。3.甲状腺功能减退症对垂体GnRHR产物分布有影响,而对卵巢、下丘脑各核团中的GnRH免疫阳性产物分布无影响。4.4个组内的下丘脑-垂体-卵巢中GnRH mRNA表达均有差异。甲状腺功能减退对组间的下丘脑-垂体-卵巢中GnRH mRNA表达无影响。5.甲状腺功能减退和妊娠因素对下丘脑-垂体-卵巢中TSH mRNA表达未发现有影响。甲状腺功能减退症对卵巢、下丘脑各核团中的TSHR分布无影响。6.甲状腺功能减退症对大鼠的妊娠产生了不利的影响。目的通过甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)的测定,观察对甲状腺功能正常孕早期妇女妊娠的影响。方法293例妊娠早期伴甲状腺功能正常的妇女作为研究人群,比较抗甲状腺过氧化物酶抗体阳性、阴性组及干预组妊娠期妇女甲状腺功能的改变;比较三组产科并发症的发生率和产后新生儿的临床特征。结果本文共研究293例,分析发现甲状腺过氧化物酶抗体阳性及阴性组孕妇甲状腺功能紊乱差异有统计学意义(P0.05),两组产科并发症之间差异有统计学意义(P0.05),阴性组与干预组产科并发症、新生儿临床特征之间差异无统计学意义(P0.05)。结论甲状腺过氧化物酶抗体阳性妊娠期妇女甲状腺功能有向亚临床甲状腺功能减退发展的倾向,甲状腺过氧化物酶抗体阳性与阴性组相比产科并发症有统计学意义,提示甲状腺过氧化物酶抗体阳性对妊娠产生不好的结果。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.256

【参考文献】