妊娠期阴道微生物群落的分布特点与GDM孕妇妊娠结局的相关性分析

发布时间：2019-07-04 08:47

【摘要】：研究背景与人体共生或寄生的不同类型微生物如细菌、病毒等被称为人类的“第二基因组”,其广泛分布于人体不同部位。分布平衡对人体健康有重要意义。部分常见性疾病如肥胖症、糖尿病、哮喘、慢性非感染性腹泻、炎症性肠道病、肠易激综合症等目前认为与细菌分布失衡存在相关性。随着检测技术的不断发展和深入,这些与人体健康密切相关的菌群的功能及其与临床相关性将越来越多被认知阴道定植着不同种属和数量的微生物,共同维持正常的阴道微环境,对女性健康具有重要的作用。阴道微生物群落菌群紊乱可引起细菌性阴道病、霉菌性阴道炎等一系列感染性疾病,每年影响数以万计的育龄期女性,并对其生活、社交、妊娠结局等均可产生影响。目前普遍认为,乳酸杆菌为阴道的优势菌群,其通过空间占位,产生乳酸、H202、生物素以及营养竞争等方式抑制着阴道内其它菌群的生长。与此同时,可通过调节机体免疫功能等方法维持着阴道的酸性环境(pH值3.8-4.4)。此前对于微生物群落菌群主要是基于显微镜检查和传统培养法而获得阴道菌群的相关信息。然而,由于阴道菌群数量巨大、种属众多,部分细菌很难通过传统纯培养和分离鉴定的方法获知。近年来随着分子生物学技术、分子遗传学以及第二代高通量测序技术的迅速发展,使得进一步认识阴道微生物群落组成成为可能。既往研究已发现,妊娠期由于多种激素分泌的改变,孕妇肠道菌群在不同孕周可发生较大改变。另外,晚孕期肠道菌群当移植进入无菌小鼠中,可诱导小鼠出现孕晚期相关生理特征。阴道微生态系统结构组成复杂,并受到多种因素影响。传统观点认为,阴道pH值、雌激素是维持阴道生态平衡和菌群结构构成的重要因素。妊娠期由于生理性的激素剧烈变化(体内雌激素水平升高),使阴道内糖原增加及堆积,有利于细菌的滋生和繁殖,容易发生阴道菌群紊乱；同时妊娠期阴道粘膜容易出现充血、水肿、细胞通透性增加,阴道粘膜屏障功能减退,加之妊娠期为了胎儿不被排斥而导致的部分免疫抑制,均是妊娠期容易出现阴道微生态菌群失衡的重要原因。阴道微生物群落菌群紊乱失衡与多种围产期并发症如绒毛膜羊膜炎、胎膜早破、早产、产褥期感染的发生密切相关。明确阴道微生物群落的组成与动态变化有助于我们进一步深入认识该类疾病的发病机制以及制定相应的防治措施。尽管目前已有研究对不同孕期阴道微生态菌群变化进行相关的研究,但仍然存在以下问题：1)阴道不同部位采样是否对研究结果产生影响；2)孕妇合并围产期并发症,如妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)时,阴道菌群如何变化及其临床意义仍无明确结论。研究目的1.孕期阴道不同部位的菌群特征差异分析2.不同孕周阴道菌群的特征分析；3.GDM孕妇阴道菌群结构多样性及与不良妊娠的关系。研究方法第一部分病例入组：随机选择就诊本院产科门诊的育龄期孕妇,年龄范围20.1-38.2岁。样本采集前30天内未服用抗生素或抗真菌药物,采集样品前48小时内无性生活,无阴道冲洗和／或局部用药。共有34例孕妇入组。样本采集：所有病例均由一位医生负责完成检查和样本采集。妇产科医生使用无菌窥阴器撑开阴道,用无菌阴道拭子分别于宫颈(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、阴道下1/3 (Vaginal canal, V)三个部位采集样品。实验流程：提取细菌基因组总DNA,使用细菌16S通用引物,扩增阴道拭子样品的16S rRNA V46保守区,将总PCR产物进行PE 101-bp测序,并获取分类操作单元(Operational-Taxonomic-Units, OTUs)。对其进行分类；最后获取样品的α-多样性、p-多样性、同时根据UniFrac距离得到OTUs系统发育树。寻找组与组之间有统计学差异的Biomarker,并进行进行统计学分析。第二部分病例入组：选择不同孕期的孕妇,分为孕中期(18.2±2.0w)和孕晚期(32.3±2.7w)与非孕期(NP)。第三部分研究对象：GDM组：在南方医院妇产科门诊首次进行常规产科检查,年龄范围19.4～39.2岁,平均28.5±3.7岁。孕16～20周,纳入志愿者共340人。由妇科医生行常规检查,将无临床其他症状或指证的阴道疾病的患者纳入研究范围。入组标准：①样本采集前30天内未服用抗生素或抗真菌药物,采集样品前48小时内无性生活,无阴道冲洗和／或局部用药；②本次妊娠前无高血压、肾脏、心血管、肝脏、血液病等疾患者；③未曾服用过可能干扰糖、脂代谢药物者(如消炎痛、酚妥拉明、速尿、噻唑类利尿剂、苯妥英钠、可的松等)；④未合并内分泌疾病(如甲亢、甲减、柯兴氏综合征)；⑤不吸烟、不饮酒者；⑥单胎妊娠、汉族。GDM诊断标准：空腹血≥5.1 mmol/L,餐后1小时血糖≥10.0mmol/L,餐后2小时血糖≥8.5mmol/L。结果有1项或以上达到或超过正常值,即诊断为GDM。对照组：同期就诊南方医院产科门诊产前检查的孕产妇,排除GDM,其他入组条件均同GDM组。样本采集：采集后穹窿的分泌物。实验流程：同第一部分和第二部分。研究结果第一部分1.1孕妇生殖道菌群总体结构乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)是阴道菌群中最主要的组成成分,而阿托波菌属,梭形杆菌属,加德纳菌属,霍氏菌属,普氏菌属,链球菌属所占的比例较小。在乳杆菌属中,我们主要观察到可以分为四亚类,分别是卷曲乳杆菌(L.crispatus),格氏乳杆菌(L.gasseri),惰性乳酸杆菌(L.iners)和詹氏乳杆菌(L.jessenii)。1.2孕妇生殖道三大采样部位在“门”水平、“属”水平菌群结构无差异孕妇生殖道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)组成。其中厚壁菌门比例达80%以上。三大采样部位宫颈(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、阴道下1/3 (Vaginal canal, V)菌属在“门”水平构成无显著差异。而“属”水平的研究发现,孕妇生殖道菌群主要由乳酸杆菌(Lactobacillus)组成,其比例达60%,其次是加德纳菌(Gardnerella)、链球菌(Streptococcus)、奇异菌属(Atopobium)、普氏菌属(Prevotella)等。但是,三大采样部位宫颈(Cervix, C)、后穹窿(Posterior fornix, P)、阴道下1/3 (Vaginal canal, V)菌属在“属”水平构成无显著差异。1.3孕妇生殖道三大采样部位α-多样性无差异生殖道菌群alpla-多样性两大指标Shannon index和PD whole tree评估三个采样部位的菌属多样性的差异。我们采用了K个对立样品的秩和检验,结果显示：无论是Shannon指数还是PD whole tree,三个部位alpha多样性均无统计学差异。第二部分2.1 不同孕周的生殖道菌群结构特征及菌型(CST)分布情况女性生殖道菌群孕中期(18.2±2.Ow)和孕晚期(32.3±2.7w)与非孕期(NP)生殖道菌群结构相似度高,主要以乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)为优势菌,比例达80%以上。孕早期(9.0±2.6w)和产后期(7.0±0.3w)生殖道菌群呈现特征性菌群结构,表现为厌氧菌如：加德纳菌(Gardnerella)、链球菌(Streptococcus)、奇异菌属(Atopobium)、普氏菌属(Prevotella)、霍氏菌属(Hallella)等比例增加。我们的数据可将阴道菌群分成四种菌型(Community state types, CSTs)。CSTI以卷曲乳杆菌(L.crispatus)为主导,CSTⅡ以格氏乳杆菌(L.gasseri)为主导,CSTⅢ则以惰性乳杆菌(Liners)为主要组成成分,CSTⅣ-A主要由少量的加德纳菌(Gardnerella),奇异菌属(Atopobium),链球菌属(Streptococcus),普氏菌属(Prevotella)和霍氏菌属(Hallella).2.2不同孕周的生殖道菌群β多样性我们通过加权的UniFrac距离(weighted UniFrac distance)展示了生殖道菌群β多样性。NP期、T2期和T3期的样品均紧紧聚集在一起,分布较集中,相似度高。而T1期分布较离散,其离散度较T2,T3更大,表明T1期菌群多样性增加。而产后组的微生物菌群分布明显不同于其他各组,离散度最大,体现产后期生殖道菌群的独特性。2.3不同孕周的生殖道菌群α多样性我们又进一步分析了不同孕周的Shannon多样性指数,与其他四组(NP非孕组,T1孕早期,T2孕中期,T3孕晚期)相比,T1期和产后组(PP) Shannon多样性指数显著增高,尤以产后组最高。2.4不同孕周的生殖道菌群差异性菌属不同孕周的生殖道菌群β多样性和alpha多样性均呈现显著差异,我们使用LEfSe寻找各组间差异菌属。T1组主要以链球菌(Streptococcaceae)丰富度增加,T3组发现红蝽杆菌(Coriobacteriaceae)和奇异菌(Atopobium)丰富度增加。NP未孕组主要以厚壁菌门(Firmicute)、乳酸杆菌(Lactobacillales)和杆菌(Bacilli)为主。而产后组(PP组)菌群特征主要是厌氧性菌属的丰富度增加,主要包括拟杆菌门(Bacteroides),梭形杆菌(Fusobacterium),加德纳菌(Gardnerella),霍氏菌属(Hallella),未知菌属(Incertae)和普氏菌属(Prevotella)等。第三部分3.1 GDM阴道菌群heatmap聚类及阴道菌群特征我们将所有的样品阴道菌群结构进行heatmap(热图)聚类分析,用菌型(Community state type, CST)来描述阴道菌群结构的分类。阴道菌群主要分为五大型(CSTⅠ-Ⅴ),其中有四型属于乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.),它们分别是：(crispatus (CST Ⅰ,39.1%)、L.gasseri (CST Ⅱ,3.9%)、Liners (CST Ⅲ, 36.3%)和L.jensenii (CST V,4.5%)。CST Ⅳ又可以分为两大亚类：CST Ⅳ-A (14.7%)和CST Ⅳ-B (1.5%)。CST Ⅳ-A的菌属主要包括：Gardnerella(加德纳菌属)、Anaerococcus(气球菌属)、Corynebacterium(棒状杆菌属)、7inegoldia(达芬戈尔德菌)、Streptococcus(链球菌)、Atopobium(奇异菌属)、Prevotella(普氏菌属)、Parvimonas(微单胞菌属)、Sneathia(纤毛菌属)、Mobiluncus(动弯杆菌属)和Peptoniphilus(吲哚嗜胨菌)。CST Ⅳ-B的特征是Atopobium(变异菌属)占主要优势菌,同时伴有CST Ⅳ-A的多样性菌属。另外,我们发现GDM组并未呈现某种特征性菌型分布,而是散在分布,与非GDM组不能区分。我们对54例GDM患者的阴道菌群进行了分类分析。在GDM患者中,13例是以惰性乳酸杆菌(L.iners)为优势菌,占31.5%,17例是以卷曲乳杆菌(L.crispatus)为优势菌,占23.5%,24例是以厌氧菌等多样性菌共存的阴道菌群特征,占45.0%。GDM阴道菌群以厌氧菌等多样性菌共存的比例上升。3.2 GDM阴道菌群alpha多样性评估菌群alpha多样性有四大指标,分别为：Shanon指数、PD whole tree、 Observed species、Chaol。结果显示,GDM组与非GDM组在Shanon指数、PDwhole tree、Observed species、Chaol四大指标均无统计学差异(P0.05),说明了GDM阴道菌群菌属的丰富度和和均度相似。3.3 GDM阴道菌群的影响因素我们采用Pearson距离和展示可能与GDM相关的因素。无论是菌型(CSTs)、孕周(Trimester)、pH、孕前BMI (Pre-BMI)都未能呈现特征性分布。结果表明,上述因素与GDM尚未发现关联。3.4 GDM阴道菌群与不良妊娠结局的关联孕期阴道菌型(CSTs)与不良妊娠结局包括：胎膜早破(Premature rupture of membranes, PROM)、分娩方式(Delivery mode)并未呈现特征性的阴道菌型聚集。统计学分析结果显示：胎膜早破、分娩方式、与菌型(CSTs)差异无统计学意义(卡方检验,P0.05)。3.5 GDM特征性菌属通过LEfSe统计发现,双歧杆菌(Bifidobacteriaceae, Bifidobacteriaies)、放线菌(Actinobacteria)和毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)在GDM组丰富度增加。Non-GDM组主要是以假单胞菌(Pseudomonadales),变形菌门(Gammaproteobacteria)丰富度增加。研究结论1.不同部位采样阴道菌群结构无明显差异；2.生殖道菌群在不同孕期呈现特征性变化。孕早期和产后期菌群结构以厌氧菌为优势菌,且菌属多样性上升；3.GDM生殖道整体菌群结构与非GDM无显著差别,但厌氧菌比例及丰富度显著升高：4.GDM与孕周、孕前BMI、阴道分泌物pH无关联；5.GDM生殖道菌群与胎膜早破及剖宫产发生无明显关联。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.259

【相似文献】