长链非编码RNA-HOST2在上皮性卵巢癌中的表达及功能机制研究

发布时间：2019-09-08 16:45

【摘要】：课题背景：卵巢癌是三大妇科恶性肿瘤之一，，致死率居首位，发病率逐年递增，但病因至今不明。卵巢癌种类繁多，其中85-90%为上皮性卵巢癌，其发生与卵巢表面生发上皮中的未分化细胞有关，这些细胞一旦发生基因突变或者在致癌基因存在时，即可转化并发展为恶性肿瘤。因此从分子生物学角度，研究上皮性卵巢癌的发生机制极为关键。人类基因组中4-9%的转录本为长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA），它们没有开放式可读框，不能编码蛋白质，长度超过200核苷酸单位。大量研究表明lncRNA作为一类功能性RNA分子，可在表观遗传、转录及转录后等水平调控其他基因的表达，从而诱导包括肿瘤在内的疾病的发生发展。因此，研究卵巢癌中特异性的lncRNA是探讨卵巢癌发生发展机制的重要手段。2003年Rangel等人发现了一个人卵巢癌组织特异性lncRNA—HOST2（Human Ovarian Cancer SpecificTranscript2），但并没有深入研究HOST2在上皮性卵巢癌中的作用机制，目前亦未见相关报道。研究目的：验证HOST2在上皮性卵巢癌中的特异性表达，通过相关实验进一步探讨HOST2在该肿瘤中的生物学功能，其潜在的调控分子和相互作用机制，及其与上皮性卵巢癌发生发展的可能联系，为上皮性卵巢癌的早期诊断和靶向治疗提供实验数据和理论依据。研究方法：通过生物信息学方法预测并筛选与HOST2相关的关键分子，及可能涉及的细胞内信号调控通路；以OVCAR-3上皮性卵巢癌细胞为细胞学实验对象，以2010年8月至2013年3月采集的50例上皮性卵巢癌组织标本、50例卵巢上皮性良性肿瘤为组织学实验对象，定量、定性并定位分析HOST2及其相关分子在上皮性卵巢癌中的表达；通过脂质体转染方法外源性改变HOST2及其相关分子的表达后，观察两者的相互作用，再通过一系列体内体外实验观察它们的表达对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响；利用报告基因实验研究HOST2与其关键分子之间可能发挥作用的microRNA。实验结果：HOST2在上皮性卵巢癌中特异性高表达，且参与上皮性卵巢癌细胞的迁移、侵袭、增殖等生物学行为，体内动物实验发现外源性降低HOST2的表达能够抑制上皮性卵巢癌的生长。HOST2序列与膜蛋白C1orf186的编码序列存在一段541个碱基几乎完全一致的区域，两者在上皮性卵巢癌中的表达密切相关（相关系数＝0.9972），HOST2与C1orf186或通过与miR1266的竞争性结合作用调控彼此的表达。C1orf186在上皮性卵巢癌中的表达亦呈特异性高水平表达，且上皮性卵巢癌中存在膜蛋白C1orf186表达阳性的一群细胞（C1orf186＋），C1orf186＋细胞的比例与上皮性卵巢癌的组织学分化程度呈负相关，且这部分细胞具有很强的致瘤能力。磷酸化STAT3蛋白在C1orf186＋上皮性卵巢癌细胞中表达高，且参与维持C1orf186＋细胞的迁移、侵袭、增殖等生物学行为，STAT3信号通路的激活在一定程度上有赖于膜蛋白C1orf186与STAT3上游信号分子JAK2的结合。结论：HOST2和C1orf186在上皮性卵巢癌中特异性高表达，两者与miR-1266的竞争性结合的结局或在一定程度上导致了上皮性卵巢癌的发生与进展。HOST2调控下的C1orf196-JAK2-STAT3信号通路可能是C1orf186＋这一细胞亚群生长得以维持的关键。HOST2和C1orf186均有潜力作为新的靶标，用于上皮性卵巢癌的靶向干预治疗。
【图文】：

调控模式,真核细胞

图 1 真核细胞内 lncRNA 的调控模式图[8]迄今为止，许多研究发现，某些 lncRNA 仅在特定的发育阶段出现[9]，具有组织和/或细胞特异性[10]；某些肿瘤中 lncRNA 的特异性表达水平可作为该肿瘤的诊断标志物和/或潜在的治疗靶点（如前列腺癌中的 DD3）[11]；某些 lncRNA 与许多肿瘤的转移有关，如 MALAT1 在早期非小细胞癌中的表达缺乏特异性，若肿瘤进展并发生转移，则其表达水平显著升高[12]，另外，MALAT1 在乳腺癌、肝癌等许多人类肿瘤中也被异常调控[13]。综上所述，LncRNA 与恶性肿瘤的发生和转移密切相关，因此，通过研究上皮性卵巢癌中特异性的lncRNA是我们揭示该恶性肿瘤发生发展机制的重要手段。2003 年 Rangel 等人利用 SAGE 数据库、分子克隆、Northern blot、RT-PCR 等技术发现在人类卵巢癌组织中存在一组特异性的转录本（human ovarian cancer-specifictranscripts, HOST1-5）, 在正常组织和非卵巢癌疾病中的表达不典型，但在四种主要类型的卵巢癌组织中均呈不同程度高水平表达[14]，尤其是上皮性卵巢癌。在这组卵巢

引物扩增,条带,细胞,第一

图 1 HOST2 引物扩增 OVCAR3 细胞 cDNA 的 PCR 产物第一列为标记条带大小用的 DNA Ladder；右侧两列为 PCR列人恶性肿瘤细胞株：MKN28、Huh-7、HepG2、McF-7、DU-2、ARK2、Hela、OVCAR-3，在每种细胞处于对数生长期且每种细胞样品中的总 RNA，经总 RNA 的反转录得到相应的 cRT-PCR 反应检测这些细胞中 HOST2 的表达。结果显示：相对中的表达，上皮性卵巢癌细胞中 HOST2 的表达特异性升高（图VCAR-3 细胞的 cDNA 样品中 HOST2 的扩增循环数比内参 5 个循环，例如：若 CTGAPDH≈19，CTHOST2≈24。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】