微囊泡循环核酸高通量测序及其在妊娠相关疾病中的应用

发布时间：2019-09-18 00:31

【摘要】：MicroRNA (miRNA),通常被认为是长度为18～22nt的单链RNA分子,这种短RNA分子通过配对靶标mRNA分子,可以形成沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)从而降解mRNA,控制蛋白质的合成。研究表明microRNA参与了一系列重要的生理过程,并且与肿瘤及多种疾病的发生密切相关。循环核酸一直以来是生物学家关注的重点,尤其是循环miRNA作为一种稳定存在血浆/血清中的RNA分子,它们的含量和组成与癌症、产前疾病、糖尿病在内的各种疾病密切相关。自从循环系统中鉴定出miRNAs以来,不少文献指出血浆/血清中的miRNA可以作为疾病的有效生物标志物,但是却很少有研究提及血浆/血清中的miRNA的来源以及稳定的原因。外囊体(exosomes)是细胞分泌至胞外的直径为30-100 nm的微囊泡,在机体体液中广泛存在。Exosomes携带有大量特异蛋白组分,同时包裹有数目可观的miRNAs,在某些病理或生理条件下,某些特定的miRNA群体会被选择性地包裹进微囊泡之中。Exosomes作为循环miRNA重要的载体可以保护miRNA,这就从一方面解释了为何循环miRNA在充斥着核糖核酸酶的循环系统中能够稳定存在的原因。女性生殖疾病和妊娠过程受到激素等分子的高度调控,同时有证据表明miRNA参与了人类乃至哺乳动物的生殖过程。经研究证实,孕妇血浆/血清中存在胎盘来源的miRNAs.子痫和妊娠糖尿病都是妊娠期的常见疾病,发病机制尚未清楚,目前用于筛查妊娠期疾病的方法准确性、敏感度普遍不高,子宫内膜癌是一类在女性生殖系统中较为常见的恶性肿瘤,目前在此方面的研究主要集中在激素和mRNA的表达差异方面。寻找与妊娠及生殖肿瘤相关的调控miRNA具有重要意义,可以深入探讨分子调控机制,并进而寻找新的分子标记物,这对生殖系统疾病的早期诊断有重要的意义。高通量测序平台在miRNA的研究中已经得到了深入广泛的应用,但是目前研究中针对微量循环miRNA测序分析的技术还不够完善,因此发展可靠的微量miRNA的高通量测序技术对于循环miRNA的研究乃至未来的无创临床诊断有基础性的作用。同时高通量测序技术产生了海量miRNA数据,充分利用测序数据将利于我们追踪疾病的发病机制,帮助提高诊断的特异性和灵敏性。本论文首先建立了Exosome中内含的核酸提取平台,就exosome提取纯化方法、exosome中DNA的分布特点以及exosome中RNA的稳定性等进行了探索研究；然后针对Exosome中miRNA含量极低的特点,结合目前较为成熟的建库试剂盒,建立了微量循环miRNA的高通量测序建库平台。利用建立好的平台,我们对妊娠糖尿病人、子痫病人的胎盘和血浆中的游离miRNA进行了高通量检测,筛选出差异表达的血浆miRNA,为研究疾病标志物提供依据；最后针对测序数据高通量的特点,基于niRNA簇／家族、miRNA异构体的分析技术对已有数据进行了探索研究。本论文主要研究内容和成果如下：1.血浆循环微囊泡及其核酸的表征血浆中的循环核酸,尤其是miRNAs,在核糖核酸酶等影响下仍然能保持完整性,这表明在血浆环境中存在某种保护核酸不被降解的机制。研究发现循环核酸可以与血浆中囊泡样亚细胞结构(exosome)结合,而囊泡结构可以将核酸与复杂的体外环境隔离,这可能是循环miRNAs表达稳定的重要原因之一。本论文对血浆中循环微囊泡进行了一系列表征和检测,为研究循环微囊泡尤其是其中的核酸的性质提供了基础性的工作。我们使用不依赖超速离心的试剂盒方法分离纯化exosome,进行电镜和粒度分析表征,从形态和大小分布上确认了提取的exosome直径在50-70nm。血浆exosome DNA质控结果显示,exosome DNA比血浆游离DNA多出400-600bp的DNA分布。我们在试验中分别比较了在4℃和-80℃下储存不同时间段以及新鲜获得的血浆及分离的exosome中RNA的浓度差异,结果表明exosome中RNA相对于血浆游离RNA的稳定性增强,不同条件下浓度波动较小。此外我们还选择了特定miRNA研究其在exosome内外的表达差异,进一步证实了exosome中miRNA稳定性很高。最后,我们为了探索不同的存储条件对miRNA表达水平的影响,对血浆样本进行反复冻融,然后与新鲜样本进行比较。结果显示对血浆RNA有很大的影响,但在exosome中miRNA的下降速度明显低于相应的血浆游离miRNA。2.微量循环miRNA测序文库制备方法的研究外周血液中的循环miRNA相对于组织中而言含量低,增加了高通量测序的建库难度,优化和改进针对微量循环miRNA的建库方法有利于循环miRNA的研究以及在临床上的应用推广。我们基于以前的工作,在定量PCR检测方法的基础上提出了一种无偏性的单链连接构建miRNA测序文库的方案,在单链接头的5’端引入了两个随机引物；同时对单链接头的5’端进行预腺苷酰化。随机通用接头和固定接头的定量PCR结果表明,随机引物的引入可以降低了链接的偏性,而固定序列接头与同样的miRNA链接时呈现出了明显的差异性。我们针对两种典型样本浓度,使用不同浓度的接头进行连接,通过PCR结果确定了高、低样本浓度下合适的接头浓度,并且验证了最适接头浓度与不同浓度原始样本链接后的线性范围。结果发现,该方法的检测线性范围能够达到8个数量级。我们将自己的建库方案与现有的商品化建库试剂盒进行比较,结果显示两种方法获得的miRNA表达水平具有高度的一致性,从而证明了基于单链接头通用连接miRNA建库方法的可靠性,适合用于微量循环miRNA的高通量测序。进一步的,我们使用自有建库方案,对血浆中游离miRNA和Exosome中miRNA进行了文库构建和测序,并对结果进行了分析研究,结果显示血清中游离的miRNA reads数和miRNA种类都显著少于Exosome,聚类分析也显示两组样本中大多数miRNAs没有表达差异,但是Exosome中niRNA纯度高,干扰背景小,是miRNA测序建库的理想样本。3.子痫病人及妊娠糖尿病人外周血循环miRNA表达谱的高通量测序分析妊娠是一个复杂的动态过程,miRNAs可能涉及了多种妊娠期疾病,比如子痫(PE)和妊娠糖尿病。我们使用高通量测序技术,重点研究了子痫和妊娠糖尿病人外周血循环miRNA表达谱。针对先兆子痫孕妇与正常孕妇两类人群比较了胎盘、母体血清、脐带血血清三类样本中miRNA表达谱的差异分析,胎盘样本中发现11种与PE相关的miRNA;母体血清中发现22种与PE相关的miRNA;脐带血血清中发现8种与PE相关的miRNA,且母血血清样本中miRNA大部来自于人类19号染色体中的19q13.42中。而后对差异表达的miRNA进行生物信息分析,研究了其所参与的靶基因及调控网络,发现这些miRNA均可能参与到了先兆子痫疾病调控网络中,外周血中的miRNA也具备早期诊断子痫疾病的潜力。由于Exosome中的miRNA比血清中游离的miRNA更加稳定,因此我们利用高通量测序技术比较了妊娠糖尿病孕妇和健康孕妇血清Exosome中的miRNA的表达差异,为妊娠糖尿病的早期诊断提供可靠的分子标记物。28个差异表达的]miRNA被挑选出来,其中12个表达显著上调,16个表达明显下调,而后进一步对5个在妊娠糖尿病混合血浆样本中高丰度miRNA进行靶标预测、功能分析和调控通路分析,筛选出5个基因和3个调控通路,这5个miRNA可能通过调控这5个基因的转录翻译,从而调控富集到的3个信号通路,导致妊娠糖尿病孕妇产生胰岛素抵抗等一系列症状,这提供了一种妊娠糖尿病人胰岛素抵抗的发病分子机制,也为妊娠糖尿病的早期诊断提供了潜在的分子标记物。4.基于高通量测序的miRNA簇／家族、isomiRs的表达分析miRNA表达谱分析通常都集中在单个miRNA基因水平上。研究表明,miRNA易在染色体上簇生排列,并常常协同表达,形成具有多样性分布的miRNA簇；同时具有相近序列成分的miRNAs进一步构成相应的miRNA基因家族。MiRNA前体序列可以形成多种在长度、序列上存在差异性的miRNA异构体(miRNA variants, isomiRs),而miRBase中注解的标准miRNA序列有时并不是isomiRs中表达丰度最高的形式。现有常规miRNA分析流程往往不能对海量数据进行深度挖掘,基于miRNA基因簇和miRNA基因家族以及isomiRs的表达谱联合分析,有利于进行miRNA表达及功能研究,可以帮助理解miRNA精细的调节网络。我们首先研究了两种同种异型细胞系(HEC-1B和ISK细胞系),作为数据分析策略的模型。单个miRNA水平上筛选出的差异表达的miRNA为105种。进一步地,我们将差异表达的miRNAs依据来源和功能分成相应的miRNA簇和家族,在ISK细胞系中有5个miRNA簇的整体表达相对于HEC-1B细胞系显著上调,有3个下调；同时,5个miRNA家族总体表达相较HEC-1B显著升高,2个显著减少。我们挑选了9种表达最丰富的miRNA考察isomiR分布谱,发现同属于mir-17簇的mir-17、 mir-18a、mir-19b的分布模式以及比例关系极为相近,而其他来源于不同簇的miRNA稍有差异。血浆]miRNA分类后的差异性isomiR和miRNA簇／家族表达谱相比标准miRNA序列而言可能会是更为有效的标志物。我们针对子痫病人的血浆miRNA进行了表达谱联合分析,发现C19MC基因簇(尤其是miR-517b, miR-519d, miR-521,miR-515-3p)整体在子痫病人的血浆中相对于正常孕妇而言显著升高,而其他基因簇则没有表现出这种协同表达的模式。而且由C19MC编码的miR-519d, miR-521和]miR-517b的isomiR表达谱极为相近,与之相比,非胎盘特异性的miRNAs(比如miR-451, miR-103和miR-145)isomiR类型和数量在血浆和胎盘中显然不同。
【图文】：

即可用流式细胞仪分析鉴定ｅｘｏｓｏｍｅ表面的分子，还可经固定后制逡逑成超薄切片用于电镜观察其形态。这种方法简便易行，只需较少的细胞，也可Ｗ逡逑在较短的时间内就可Ｗ完成。分析结果不会受其它细胞蛋白和胎牛血清成分的干逡逑扰。逡逑１．４．逦４邋Ｅｘｏｓｏｍｅ的分子组成及其功能逡逑Ｅｘｏｓｏｍｅ独特的蛋白组成取决于不同的细胞起源。Ｅｘｏｓｏｍｅ膜上分布有许多逡逑共刺激分子ＣＤ８６、ＣＤ８０和四跨膜区蛋白分子，如ＣＤ６３、ＣＤ３７、ＣＤ８１、ＣＤ８２逡逑等，与上述的ＭＨＣ－ＩＩ复合物及共刺激分子协同发挥免疫刺激靴细胞的作用。而逡逑ｅｘｏｓｏｍｅ中选择性富集的整合素、郭豁附素和ＣＤ分子等，贝ｉｊ介导ｅｘｏｓｏｍｅ对效逡逑应细胞的{南蚬δ埽�还聚集着大量的细胞来源的胞质蛋白，如膜连蛋白、小ＧＴＰ逡逑结合蛋白和一些细胞骨架相关蛋白，参与ｅｘｏｓｏｍｅ的发生形成，与浆膜融合向细逡逑胞外释放Ｗ及与其它细胞融合的过程。逡逑ｍｉＲＮＡ邋怤过微粒（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）逡逑

逦６００逦１０００逦３０００逦１０３８０邋［ｂｐ］逡逑Ｂ逡逑图２－３血浆ｅｘｏｓｏｍａｌＤＮＡ与血浆ＤＮＡ片段长度分布的比较，Ａ为ｅｘｏｓｏｍａｌＤＮＡ的片段逡逑长度分布：Ｂ为血浆ＤＮＡ的片段长度分析。逡逑２３逡逑？．八ｉ逦－？逦－．１’．－＇．邋＇逡逑
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.2

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本文编号：2537180