不明原因复发性流产与蜕膜组织中巨噬细胞自噬状态之间关系探讨
发布时间：2019-10-15 22:01
【摘要】：目的探讨不明原因复发性流产与蜕膜组织中巨噬细胞自噬状态之间的关系。方法根据流产情况分为不明原因复发性流产组(观察组)和人工流产组(对照组),每组病例各30例。将蜕膜组织制成细胞悬液后分离淋巴细胞,通过CD14+免疫磁珠分选巨噬细胞,抗F4/80检测纯度,比较两组中巨噬细胞数量。通过免疫组化检测蜕膜中巨噬细胞表达,评价巨噬细胞与流产间关系;通过RT-q PCR检测细胞自噬相关基因Atg5,Atg7,LC3-Ⅱ和Bnip3表达水平的改变;Western Blot检测LC3-Ⅱ水平以评价自噬状态,对比两组之间差异。结果观察组中巨噬细胞纯度为(88.87±3.89)%,对照组为(82.84±3.98)%,差异有统计学意义(t=5.93,P0.01)。巨噬细胞在观察组中阳性表达率为96.7%(29/30)高于对照组中的80.0%(24/30)。观察组中自噬相关基因ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ和Bnip3的m RNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(t值分别为2.90,2.67,12.00,12.13,P值均0.01)。Western Blot检测显示观察组中LC3-Ⅱ相对表达量为0.51±0.23,对照组为0.24±0.09,差异有统计学意义(t=5.96,P0.01)。结论在不明原因复发性流产病例中,蜕膜中巨噬细胞的自噬高于对照组,巨噬细胞的自噬与不明原因复发性流产的发生有一定的相关性。
【图文】：
0.000175）；观察组中巨噬细胞含量为（2.29±0.16）×106/mL；对照组为（2.13±0.01）×106/mL两组间差异有统计学意义（t=5.50,P=0.000698）。2.2免疫组化检测蜕膜中巨噬细胞情况以抗F4/80为单抗，蜕膜组织石蜡切片为标本行免疫组化，检测蜕膜组织中各组巨噬细胞含量。巨噬细胞在观察组与对照组中均有表达（见图1），但是在观察组中阳性表达率为96.7%（29/30）远远高于对照组中的阳性率80.0%（24/30）（见表1）。χ2检验显示两组间差异有统计学意义(χ2=4.04，P=0.021）。a、b:观察组c、d:对照组图1免疫组化检测两组蜕膜组织中巨噬细胞含量（免疫组化×200）表1免疫组化检测两组巨噬细胞含量（例）组别观察组对照组例数3030F4/80蛋白的表达（染色强度×阳性细胞百分比）-16+26++1010+++1782.3蜕膜组织中巨噬细胞自噬现象的检测2.3.1RT-qPCR方法检测与细胞自噬相关的基因表达水平的改变从新鲜蜕膜组织中获取的巨噬细胞，抽提RNA后经凝胶电泳验证，证实mRNA保存完整。见图2。图2RNA电泳图通过RT-qPCR扩增巨噬细胞中的自噬相关基因ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ和Bnip3的mRNA，与内参比较获得其相对表达量。其中观察组中ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ和Bnip3的mRNA相对表达量分别··765
。4个自噬相关基因mRNA表达水平在两组间差异有统计学意义（t值分别为2.90，2.67,12.00,12.13，P值分别为0.006,0.011,0.000和0.000），观察组中自噬相关基因的表达水平高于对照组。2.3.2WesternBlot检测两组LC3-Ⅱ表达情况以GAPDH蛋白表达为内参照，，观察组中LC3-Ⅱ表达量为0.51±0.23，对照组表达量为0.24±0.09，两组之间差异有统计学意义(t=5.96,P=0.000)。图3为部分样本中LC3-Ⅱ的WesternBlot检测结果。图4为所有样本LC3-Ⅱ表达量的WesternBlot检测结果散点图。泳道1~3、7~9：观察组；泳道4~6、10~12：对照组图3LC3-ⅡWesternBlot结果（部分样本）图4LC3-Ⅱ表达量的散点图（所有样本）3讨论巨噬细胞是调控母体免疫状态产生免疫耐受的重要细胞，从而决定胚胎是否可以免受免疫打击而流产［6-8］。巨噬细胞是天然性免疫和获得性免疫的桥梁，通过识别并耐受胚胎抗原直接影响妊振结局，巨噬细胞的功能异常是导致母胎耐受异常、流产发生的重要原因［9-11］，研究已经证明在流产的动物模型及临床标本中巨噬细胞均处于活化状态。我们的研究也证实这点，在流产病例中蜕膜组织的巨噬细胞含量增加，并且巨噬细胞处于活化状态。3.1巨噬细胞的免疫调节作用在免疫网络中巨噬细胞既是免疫效应细胞，又是免疫调节细胞［12-13］。（1）正相调节作用：体内的巨噬细胞一般处于静止状态，当受到某些因素如病原体等异物或细胞因子等刺激后活化，活化的巨噬细胞功能明显增强，不但吞噬各种病原体，杀伤肿瘤细胞，而且还向T细胞提呈抗原，分泌细胞因子参与免疫应答，该作用称为免疫正相调节作用。（2）负相调节作用：巨噬细胞中还存在一种抑制性巨噬细胞，分泌多种可溶性抑制物如前列腺素、活性氧分子等抑制淋巴细胞增
【作者单位】： 中山大学孙逸仙纪念医院妇产科;
【基金】：广东省科技社会发展项目(2012B032000006)
【分类号】：R714.21
【图文】：
0.000175）；观察组中巨噬细胞含量为（2.29±0.16）×106/mL；对照组为（2.13±0.01）×106/mL两组间差异有统计学意义（t=5.50,P=0.000698）。2.2免疫组化检测蜕膜中巨噬细胞情况以抗F4/80为单抗，蜕膜组织石蜡切片为标本行免疫组化，检测蜕膜组织中各组巨噬细胞含量。巨噬细胞在观察组与对照组中均有表达（见图1），但是在观察组中阳性表达率为96.7%（29/30）远远高于对照组中的阳性率80.0%（24/30）（见表1）。χ2检验显示两组间差异有统计学意义(χ2=4.04，P=0.021）。a、b:观察组c、d:对照组图1免疫组化检测两组蜕膜组织中巨噬细胞含量（免疫组化×200）表1免疫组化检测两组巨噬细胞含量（例）组别观察组对照组例数3030F4/80蛋白的表达（染色强度×阳性细胞百分比）-16+26++1010+++1782.3蜕膜组织中巨噬细胞自噬现象的检测2.3.1RT-qPCR方法检测与细胞自噬相关的基因表达水平的改变从新鲜蜕膜组织中获取的巨噬细胞，抽提RNA后经凝胶电泳验证，证实mRNA保存完整。见图2。图2RNA电泳图通过RT-qPCR扩增巨噬细胞中的自噬相关基因ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ和Bnip3的mRNA，与内参比较获得其相对表达量。其中观察组中ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ和Bnip3的mRNA相对表达量分别··765
。4个自噬相关基因mRNA表达水平在两组间差异有统计学意义（t值分别为2.90，2.67,12.00,12.13，P值分别为0.006,0.011,0.000和0.000），观察组中自噬相关基因的表达水平高于对照组。2.3.2WesternBlot检测两组LC3-Ⅱ表达情况以GAPDH蛋白表达为内参照，，观察组中LC3-Ⅱ表达量为0.51±0.23，对照组表达量为0.24±0.09，两组之间差异有统计学意义(t=5.96,P=0.000)。图3为部分样本中LC3-Ⅱ的WesternBlot检测结果。图4为所有样本LC3-Ⅱ表达量的WesternBlot检测结果散点图。泳道1~3、7~9：观察组；泳道4~6、10~12：对照组图3LC3-ⅡWesternBlot结果（部分样本）图4LC3-Ⅱ表达量的散点图（所有样本）3讨论巨噬细胞是调控母体免疫状态产生免疫耐受的重要细胞，从而决定胚胎是否可以免受免疫打击而流产［6-8］。巨噬细胞是天然性免疫和获得性免疫的桥梁，通过识别并耐受胚胎抗原直接影响妊振结局，巨噬细胞的功能异常是导致母胎耐受异常、流产发生的重要原因［9-11］，研究已经证明在流产的动物模型及临床标本中巨噬细胞均处于活化状态。我们的研究也证实这点，在流产病例中蜕膜组织的巨噬细胞含量增加，并且巨噬细胞处于活化状态。3.1巨噬细胞的免疫调节作用在免疫网络中巨噬细胞既是免疫效应细胞，又是免疫调节细胞［12-13］。（1）正相调节作用：体内的巨噬细胞一般处于静止状态，当受到某些因素如病原体等异物或细胞因子等刺激后活化，活化的巨噬细胞功能明显增强，不但吞噬各种病原体，杀伤肿瘤细胞，而且还向T细胞提呈抗原，分泌细胞因子参与免疫应答，该作用称为免疫正相调节作用。（2）负相调节作用：巨噬细胞中还存在一种抑制性巨噬细胞，分泌多种可溶性抑制物如前列腺素、活性氧分子等抑制淋巴细胞增
【作者单位】： 中山大学孙逸仙纪念医院妇产科;
【基金】：广东省科技社会发展项目(2012B032000006)
【分类号】：R714.21
【参考文献】
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1 张宗梁,宋秋宝,林明群,丁跃梅,康小伟,姚
本文编号：2549851
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/fuchankeerkelunwen/2549851.html
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