GnRH类似物联合顺铂抑制耐药卵巢癌细胞侵袭转移和血管形成的研究

发布时间：2019-10-17 21:55

【摘要】：目前卵巢癌患者发病年龄呈现年轻化，发病率逐年升高，在妇科恶性肿瘤中仅次宫颈癌，死亡率却居于榜首。卵巢癌目前临床上公认的治疗方案是：满意的肿瘤细胞减灭术+铂类为基础的联合化疗，但患者病情好转后复发的比例高达70%-80%。大量临床工作者总结发现卵巢癌易发生癌灶转移，手术常常不能完全切除，且易对化疗药物产生耐药（尤其以对铂类的耐药多见）。故复发性卵巢癌的扩散转移和化疗耐药始终是治疗的两大难点，是影响患者预后最主要的因素。难治性复发性卵巢癌患者目前的治疗方案主要有：手术、放疗、化疗、免疫治疗以及内分泌治疗等，其中内分泌治疗是目前研究的热点之一，而在内分泌治疗中又以促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing-hormone，GnRH）类似物的运用研究最为广泛。人工合成的GnRH类似物是天然GnRH生物学效应的50-100倍，可以竞争性与垂体的GnRH受体结合，抑制LH、FSH的分泌，引起促性腺功能的抑制效应，80%的GnRH类似物与GnRH-Ⅰ受体结合。卵巢癌是一种性激素依赖性肿瘤，约80%的人类卵巢上皮性癌组织中有GnRH-Ⅰ受体的表达。肿瘤细胞的侵袭转移和血管生成是影响肿瘤远处转移的重要方面。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是锌离子依赖的蛋白水解酶，可有效降解细胞外基质，被认为在肿瘤的侵袭、转移中发挥着重要作用；组织金属蛋白酶抑制剂（Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）能特异性地与MMPs的结合，降低MMPs的活性，两者的失衡作为研究细胞侵袭和转移的最重要的方向。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知活性最强、专属性最高的血管生成因子，常被当做血管生成的最重要的研究分子。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是肿瘤信号转导通路上的一个重要因子，大量研究证实EGFR可诱导MMPs活性增强，TIMPs活性降低，两者平衡失调，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。且EGFR与血管生成密切相关，可以通过促进VEGF的高表达，来诱导肿瘤的血管生成。GnRH类似物可以与卵巢癌细胞表面的GnRH-1型受体结合，下调EGFR的活性。课题组的前期实验证实，伴随铂类耐药卵巢癌（OVCAR-3/CDDP）细胞耐药性越高，EGFR表达也越高，侵袭侵袭转移能力越强；GnRH类似物可下调OVCAR-3/CDDP细胞EGFR的表达。那么是否可以通过GnRH类似物下调耐药卵巢癌细胞EGFR的表达，来抑制其侵袭转移和血管生成？本实验将研究GnRH类似物与顺铂两药联合对铂类耐药卵巢细胞的侵袭转移和血管生成的作用，并对其相关可能的机制进行探索。目的：观察GnRH类似物—曲普瑞林（Triptorelin）联合顺铂对铂类耐药人卵巢癌细胞（OVCAR-3/CDDP）侵袭转移和血管生成的作用，并对其可能的分子机制进行研究。方法：前期采用CDDP浓度逐步递增、间歇作用的方法体外诱导卵巢癌（OVCAR-3）细胞耐药性，目前达到中度耐药。实验按照不同的处理方法分为：(1)生理盐水对照组：(2)顺铂组；(3)曲普瑞林处理组；(4)曲普瑞林联合顺铂组处理组。采用Real-time法检测不同药物处理组对铂类耐药卵巢癌OVCAR-3/CDDP细胞EGFR,VEGF,MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的mRNA相对表达量的影响;Western blot蛋白免疫印记法检测VEGF蛋白表达的变化；划痕实验和Transwell小室侵袭实验比较耐药卵巢癌细胞的侵袭转移能力变化；鸡胚尿囊膜实验检测对铂类耐药卵巢细胞荷瘤组织的血管生成的影响。结果:（1）与对照组和单药处理组相比，曲普瑞林和顺铂两药联合使OVCAR-3/CDDP细胞的EGFRmRNA的表达降低，同时下调VEGF,MMP-2，MMP-9的mRNA表达，TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达量上升，，差别有统计学意义(P0.05)。(2)曲普瑞林和顺铂处理组与对照组相比，OVCAR-3/CDDP细胞的VEGF蛋白表达减少，差别有统计学意义(P0.05)；两药联合组与对照组及单药处理组相比，VEGF蛋白的表达降低，差别有统计学意义(P0.05)。(3)划痕实验中各不同药物处理组与对照组相比，划痕愈合率均降低，且Transwell小室穿膜细胞数也降低，差别有统计学意义(P0.05)；且与单药处理组相比，两药联合处理组表达更低，差别有统计学意义（P0.05）。(4)鸡胚尿囊膜实验结果：曲普瑞林和顺铂单独用药均能抑制耐药荷瘤组织的血管形成，抑制率分别为20.76%和16.66%；两药联合作用后抑制作用更显著，抑制率达36.50%。结论：在耐药卵巢癌细胞株OVCAR-3/CDDP中，曲普瑞林和顺铂可抑制耐药卵巢癌的的侵袭转移和血管生成，且两药联合运用抑制效果较单药更为显著。GnRH类似物对于出现铂类耐药的复发性卵巢的临床治疗可能具有很大的潜力。
【图文】：

表达水平,细胞侵袭,顺铂,处理组

图 1：各不同处理对 EGFR mRNA 表达水平的影响注：A 为对照组，B 曲普瑞林处理组，C 两药联合组，D 顺铂组*：与对照组相比，P<0.05；#与两药联合相比，P<0.05细胞侵袭转移相关因子 MMP-2/TIMP-2，M达检测

细胞迁移,划痕试验,细胞

图2：各组细胞划痕试验细胞迁移能力变化。图3:各组细胞划痕愈合率的变化人工伤痕(Oh)和愈合情观(48h)比较注：A 为对照组，B 曲普瑞林处理组，C 两药联合组，D 顺铂组*：与对照组相比，P<0.05；#与两药联合相比，P<0.05。4、耐药卵巢癌细胞侵袭能力的检测OVCAR-3/CDDP 加入铺有 Matrigel 胶的 Transwell 小室，上室加入含有各组药物的无血清培养基，下室加入含血清培养基，24 小时后，擦去膜表面的细胞及 Matrige胶，固定染色后拍照（图 4），计算膜细胞数（图 5）。结果发现：两药联合能够抑
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】