microRNA在绝经后女性盆底器官脱垂中的作用机制研究

发布时间：2019-10-28 21:09

【摘要】：【背景】盆底器官脱垂(Pelvic organ prolapse， POP)是中老年女性的常见疾病，严重影响患者身心健康。大样本流行病学调查显示妊娠、分娩、绝经、高龄、慢性腹压增加是该病的主要危险因素。目前认为上述因素导致的盆底支持组织的损伤和修复障碍是POP发生的主要机制。按照基因组学和遗传学的理论，疾病发生的分子基础是基因缺陷，人类几乎所有的疾病都与基因缺陷存在直接或间接关系。国内外多项遗传、流行病学调查的研究都提示遗传因素参与盆底POP的发生、发展。虽然病因学研究已经从宏观意义上日渐证实POP发生发展的主要原因是盆底支持组织的损伤，然而这些研究多局限于疾病表观以及形态学改变等方面，尚没有哪种分子机制得到深入研究并为广泛接受。一般认为基因缺陷导致盆底细胞外基质结构及功能异常是POP发生发展的重要分子基础。胶原纤维作为细胞外基质的重要组成部分，以筋膜、韧带等形式给予盆底组织抗拉伸强度，在维持盆底器官正常位置和功能中发挥重要作用。胶原的含量、分布和排列是维持组织功能的重要因素，一旦发生改变，在一定程度会影响盆底支持组织的性能及生物力学构建，从而促使POP的发生发展。已知胶原有28种亚型，在不同组织中胶原亚型的分布不同，差异巨大，在韧带组织中，I型胶原为主，在阴道壁组织中，以Ⅲ型胶原为主。目前国内外许多学者从胶原含量、胶原亚型比例的变化等方面揭示了POP发生的分子特征[1-3]。这些研究由于采集的组织样本不同、研究方法不同等原因，尚没有形成观点一致的结论。因此，明确POP患者盆底组织内胶原蛋白表达模式并探讨其合成和降解的调控途径，有助于阐明POP发生发展的机制，有助于立足发病机制制定有效的干预策略。 microRNA（miRNA）是一类长约20-25个核苷酸的内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物体内。研究表明成熟的miRNA能降解靶mRNA或者阻遏靶mRNAs的翻译而发挥表观调控效应。miRNA通过负向调节靶基因的表达，参与基因组30%基因的表达调控，包括发育、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等多种生理及病理过程。近年来，miRNA对细胞外基质的调控研究引起高度重视，其中胶原蛋白、层粘连蛋白、转化生长因子β、弹性蛋白、基质金属蛋白酶表达调控，涉及miR-590，miR-155，miR-7， miR-21，miR-30、miR-29及miR-133等多个家族，在发育分化、增殖凋亡、免疫调控、炎性浸润、肿瘤迁移等方面取得一定进展[4-6]。基于对miRNA这一表观遗传学调控机制的逐步了解，为研究POP发生发展相关miRNA的分子机制提供了新思路及可供借鉴的实践方法。当前，应用高通量芯片技术进行miRNA表达谱分析、生物信息学预测及鉴定其靶基因以及进一步研究其生物学功能的实验方法得到广泛应用。特别是探索组织特异性miRNA在基因表达调控网络中的功能，可揭示其在疾病发生发展过程中的重要作用，为miRNA在疾病基因诊断、治疗的临床应用提供重要的实验依据。阴道前壁包含膀胱阴道筋膜，与韧带等其它盆底结缔组织有着共同的胚胎起源[7]，是盆底支持组织中最常和最易受损伤的部位，其成分改变可间接反映盆内筋膜的变化[8,9]。理解其形态功能及其对应的分子调控机制，对于阐明POP的发病机制至关重要。迄今为止，国内外尚无POP组织特异性miRNA表达谱分析的研究报道。因此开展对POP患者的阴道壁miRNA表达谱分析，并结合生物信息学深入探讨其对POP发病基础的细胞外基质的调控研究，不仅有其理论上的可行性及实践上的可操作性，还有较广阔的临床转化应用前景。【目的】本研究以高通量芯片技术检测为基础，探寻差异表达miRNA，以期构建绝经后POP阴道壁组织miRNA表达谱，为POP领域miRNA的研究指明方向；借助已有的生物信息学平台，对差异表达的miRNA进行靶基因预测，以期以miRNA为出发点，构建绝经后POP阴道壁组织基因表达谱，从而有效缩小POP领域候选基因研究范围，使得后续基因研究更有可行性和科学性；从mRNA和蛋白水平开展研究，以期明确盆底组织细胞外基质蛋白的表达模式，从而揭示胶原参与POP进展的分子基础；开展靶向调控研究，观察靶标mRNA表达水平的变化，以期明晰miRNA对细胞外基质合成、代谢及降解转录调控机制，从而揭示miRNA参与POP进展的分子基础，为阐明POP发病机制提供新思路；为开发个体化的POP预警、疗效判断及预后指标及分子水平的基因诊治技术提供新视角。【方法】 1.严格匹配年龄、绝经状态、体重指数、阴道分娩次数以及相关病史等POP发生发展的重要影响因素，选取5例绝经后POP与5例绝经后无POP患者，以阴道前壁正中近穹窿处组织为研究样本。 2.用mirVana miRNA Isolation Kit提取total RNA，检测其纯度、总量及完整性，FlashTag Biotin RNA Labeling Kit进行生物素标记，然后用Affymetrix GeneChip miRNA Array3.0进行miRNA表达谱分析，利用SAM（significance analysis ofMicroarrays）R程序包分析差异miRNA，筛选标准是：Fold Change≥2提示表达上调，Fold Change≤0.5提示表达下调；Q-value≤5%提示差异具有统计学意义。 3.借助生物信息学技术，运用TargetScan、PicTar和miRanda等软件对差异miRNA进行靶基因预测。为了减少假阳性率，，提高预测的准确性，挑选出同时出现在3个预测软件中的基因，作为其可能的候选靶基因，以miRNA为出发点，构建绝经后POP阴道壁组织基因表达谱。 4.查阅国内外POP相关基因组学研究文献，总结出与POP发病机制相关的差异表达基因。 5.复合分析生物信息学软件预测的miRNA靶基因与基因组学研究揭示的差异表达基因，筛选出共有基因作为研究对象。 6.进一步扩大POP组和对照组样本量至各组10例，利用实时荧光定量PCR、WesternBlot技术分析绝经后POP组和对照组差异miRNA及其靶基因mRNA和蛋白的表达水平，验证miRNA芯片的准确性。 7.钓取miRNA靶基因3’UTR区的基因序列，并将其克隆到psiCHECKTM-2载体3'UTR区的多克隆位点，构建靶基因的野生型报告载体；对靶基因3'UTR区的miRNA结合位点进行突变，并将其克隆到psiCHECKTM-2载体3'UTR区的多克隆位点，构建含有miRNA突变靶位点的突变型报告载体；将这两个载体分别与miRNA mimics、mimics negative control（mimics NC）共同转染293T细胞，用双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性变化。【结果】 1.对提取的组织total RNA进行紫外分光光度计分析，显示total RNA量在9.89ug到21.88ug之间，A260/280在1.99到2.03之间；电泳条带清晰，RNA完整性好；样品RNA满足Affymetrix GeneChip miRNA3.0芯片要求。 2.10张Affymetrix GeneChip miRNA3.0芯片的各项检测参数，包括B2Oligo的杂交表现、芯片的平均背景值以及噪音值、Spike-in Control Oligos以及EukaryoticHybridization Controls的信号值均满足芯片质控要求，提示样品与AffymetrixGeneChip miRNA3.0芯片的杂交模型建立成功。 3. Affymetrix GeneChip miRNA3.0表达谱芯片共筛选出44个在绝经后POP患者阴道壁组织中呈2倍以上表达上调的miRNA。 4.生物信息学方法预测差异miRNA的靶基因，与已有的基因芯片研究成果进行交叉比对、双向筛选，最终确定hsa-miR-196a作为下一步研究对象，并预测COL3A1为其候选靶基因。 5.扩大样本含量至每组10例组织标本，荧光定量实时PCR提示hsa-miR-196a在绝经后POP组表达显著上调，达21.71倍。 6.荧光定量实时PCR及Western Blot从mRNA和蛋白水平证实POP患者阴道壁组织中COL3A1的表达水平显著下调。 7.双荧光素酶报告基因系统检测显示：在转染克隆有COL3A1基因3'UTR区的野生型报告载体的实验中，hsa-miR-196a mimics组与空白对照组以及hsa-miR-196aNC组相比，荧光素酶活性显著下降，仅为hsa-miR-196a NC组的48%，hsa-miR-196a NC组与空白对照组相比，荧光素酶活性无明显变化；在转染克隆有COL3A1基因3'UTR区的突变型报告载体的实验中，hsa-miR-196a mimics组与空白组和hsa-miR-196a NC组相比较，荧光素酶活性无明显差异。【结论】 1.芯片是研究miRNA的重要手段，miRNA芯片技术使得筛选与特定的生长发育阶段或者特定的疾病相关的miRNA更为容易和便捷。本研究Affymetrix GeneChipmiRNA3.0表达谱分析共筛选出44个在POP患者阴道壁组织中呈2倍以上表达上调的miRNA，推测这些miRNA可能参与了POP的发生、发展。 2. COL3A1表达失衡是POP发生发展的分子基础，其在mRNA及蛋白水平的表达均显著下调。 3. hsa-miR-196a在绝经后POP患者阴道壁组织中显著上调，COL3A1是其靶基因，hsa-miR-196a的种子序列通过与COL3A13'UTR区结合诱导COL3A1mRNA降解，实现对COL3A1的负向调控。 4. hsa-miR-196a参与了POP的发生、发展。在POP中，hsa-miR-196a表达水平显著上调，通过负向调控靶标COL3A1，导致阴道组织III型胶原含量下降，可能是POP发生的重要机制之一。考虑到阴道壁组织的胶原构成是以Ⅲ型胶原为主，这种机制显得更为重要。miRNA为探索盆底功能障碍性疾病的发生发展机制提供了新的视野。【展望】本研究发现了44个在POP患者阴道壁组织中呈2倍以上表达上调的miRNA，考虑到每个miRNA都可能存在数十个甚至几百个靶基因，而每个靶基因可能接受多个miRNA的调控，后续还有很多工作要做，miRNA参与POP发生发展机制的研究才刚刚开始。 miRNA只有20个碱基左右，成熟后即刻被蛋白质包裹，不易被RNase降解，可以稳定存在于血液、尿液等体液中，因此非常容易进行检测。大量的研究表明，miRNA表达的失调是一些疾病过程的起因或者指示剂，它们的表达因疾病而异，这一发现说明miRNA的表达特征可作为疾病诊断和预防的生物标志物。在POP领域的深入研究，有望从miRNAs层面预测POP易感人群，从而进行早期干预，减少该类疾病的发生和进展。此外，也有很多学者从靶向miRNA的角度或者miRNA诱导基因沉默的角度对疾病的治疗进行了探讨，虽然尚未取得突破性进展，但却为我们治疗POP提供了新的思路，指明了新的研究方向。
【图文】：

流程图,芯片编号,检测技术,流程

1 Affymetrix miRNA 表达谱芯片检测技术与芯片编号及分组ymetrix miRNA 3.0芯片编号 RNA样0200925544082314417985814250 121150200925544082314417985814267 121150200925544082314417985814203 121150200925544082314417985814244 121150200925544082314417985814219 121150200925544082314417985814197 121150200925544082314417985814213 121150200925542082314417985814046 121150200925544082314417985814248 121150200925544082314417985814199 12115

数据处理流程,芯片,层次聚类算法,信号值

后的miRNA信号值，首先进行log转换，然后采用平均连锁、层次聚类算法进行聚类分析，结果用聚类图表示。数据处理流程如下（图1-2）：图1-2 芯片数据处理流程
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R711.2

【参考文献】