抑制JNK3促进BH3模拟物S1诱导的人卵巢癌耐药胞凋亡

发布时间：2019-11-22 00:59

【摘要】：卵巢癌是女性常见肿瘤，位居女性肿瘤发病率第五位和妇科肿瘤致死率第一位。手术和基于铂类药物的联合化疗是其常规治疗手段，但是因其近70%复发和耐药的形成，致使其五年期生存率不高于40%。所以对卵巢癌耐药机制的深入研究尤为必要。研究显示，卵巢癌耐药的产生与抗凋亡的Bcl-1家族成员（如Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL等）高表达紧密相关，这使得抗凋亡和促凋亡相之间的平衡发生倾斜，促使细胞逃逸凋亡而产生耐药。近年来将靶向于Bcl-2家族抗凋亡蛋白的特异性抑制剂应用于肿瘤治疗，相关基础研究不断增加。现已开发了一系列模拟促凋亡成员BH3结构域的小分子抑制剂（如ABT-737/263、Obatoclax和AT-101等）。新型BH3模拟物S1能够同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL，并具有较高的亲合力。已有报道显示S1能够诱导胶质瘤细胞U251、白血病细胞K562、肝癌细胞SMMC-7721、肺癌细胞SCLC、卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/DDP等多种肿瘤细胞系发生凋亡。本研究室已有研究显示S1在胶质瘤细胞及卵巢癌细胞中，经由线粒体途径介导了凋亡的发生，同时也发生了内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）途径诱导的凋亡，内质网凋亡蛋白Caspase-4信号级联及(c-Jun N-terminalkinase, JNK)途径被激活。ERS触发的未折叠蛋白反应（Unfolded ProteinResponse，UPR）既可能作为适应性途径缓解细胞所面临的应激状态，也可能因严重应激而促使细胞发生凋亡。目前认为，UPR信号途径可以诱导细胞自噬而发挥抵抗凋亡的效应，而Bcl-2家族蛋白与UPR、自噬和凋亡等信号转导途径密切相关。因此，靶向抗凋亡蛋白Bcl-2的BH3模拟物则通过直接或间接影响这些信号转导途径而决定细胞的命运。研究结果显示UPR信号途径的主要通路之一(inositol-requiring kinase1, IRE1)可激活JNK，JNK既能激活凋亡信号，又能介导自噬的活化，还能够调节活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成，对细胞命运的决定至关重要。然而，已有研究多采用JNK广谱抑制剂，无法区别与验证JNK亚型的作用，最近发现的新的特异性抑制剂等为研究JNK亚型的功能提供了可能。本研究中，我们采用BH3模拟物S1处理人卵巢癌耐药细胞，以高通量方式对UPR信号通路相关84个基因进行筛选，发现JNK3持续高表达，并通过应用特异性抑制剂Ⅻ和siRNA对JNK3表达在人卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP中的作用及机制进行了探讨。方法 (1) MTT法检测BH3模拟物S1处置卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP存活率。 (2) S1处置卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP，采用PCR array法检测UPR信号通路84种基因变化，筛选差异表达基因；qPCR确认JNK1、JNK2和JNK3表达基因变化；Western Blot分析JNK3蛋白表达变化。 (3)根据JNK3的基因序列（GenBank：NM_002753）以及RNAi设计原理，构建三条寡核苷酸序列沉默其表达，命名为Si1，Si2和Si3，并通过荧光标签、RT-PCR、Western blot等技术进行验证，筛选有效沉默序列。 (4)利用JNK3特异性抑制剂Ⅻ和siRNA进行干预，光镜下观察细胞形态变化，MTT法检测细胞存活率；TUNEL染色法检测凋亡变化。 (5)利用JNK3特异性抑制剂Ⅻ和siRNA进行干预，Western blot分析Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白的表达；Western blot分析JNK下游信号分子c-Jun、p-c-Jun、p53、Noxa和Bax蛋白表达变化；JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势的变化；同时，Western blot分析细胞内质网应激相关蛋白Grp78和CHOP的表达。 (6) DCFH-DA染色观察人卵巢癌耐药细胞ROS水平；抗氧化剂NAC预处理细胞后合用S1和抑制剂Ⅻ，MTT法检测细胞存活率。 (7) AO及Lyso-Tracker Red染色检测胞内酸性结构累积情况；Western blot检测LC3-Ⅱ及p62蛋白的表达；自噬抑制剂氯喹与S1合用检测存活率。结果 1. MTT检测显示，S1能够剂量依赖性及时间依赖性降低卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP的存活率。 2. PCR array法检测结果显示，在短时间点（3h）UPR信号通路多种未折叠蛋白伴侣分子（包括PERK、ATF6和IRE1三条应答途径）表达上调应答了应激，长时间点（24h）则呈下降趋势，表明ERS趋缓，而JNK3则持续高表达，同时JNK家族其他亚型无明显变化。Western blot检测也显示JNK3蛋白水平表达上调。 3.结合mRNA及Western blot检测确认Si3为JNK3有效沉默序列。 4.较之S1处理，抑制剂Ⅻ和siRNA干预后，光镜下皱缩细胞增多；细胞存活率显著降低；抑制剂Ⅻ与S1联合应用后细胞凋亡率增加。 5.较之S1处理，抑制剂Ⅻ或siRNA与S1合并干预后，Bcl-2表达降低，同时Cleaved Caspase-3蛋白的表达增加；JNK靶标分子c-Jun、p-c-Jun表达明显下降；而c-Jun的负性调节靶标p53表达上调，相应地，p53下游分子Noxa和Bax表达亦明显上调；线粒体膜电位显著下降；未折叠蛋白反应伴侣分子Grp78表达降低、CHOP表达升高。 6.抑制剂Ⅻ与S1联合应用后，胞内ROS水平显著增加，氧化损伤导致的存活率降低可被抗氧剂NAC所逆转。 7. AO及Lyso-Tranker Red染色结果显示抑制剂Ⅻ与S1联合应用后胞内酸性结构明显增多；同时LC3-Ⅱ表达在S1组、S1合并Ⅻ处理组均显著增加，p62表达在合并处理组显著增加，相应地siRNA干预后也呈现出LC3-Ⅱ和p62表达升高的趋势；氯喹合并S1处理SKOV3/DDP细胞进一步降低了存活率。结论 1. BH3模拟物S1能够降低卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP存活率；UPR相关基因JNK3的高表达可能与SKOV3/DDP对BH3模拟物S1的敏感性密切相关。 2.抑制JNK3可通过阻断其下游靶蛋白c-Jun的活化，诱导p53表达增加，，上调凋亡相关蛋白Noxa和Bax的表达，从而加剧S1诱导卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP凋亡。 3.抑制JNK3通过促进细胞氧化损伤从而提高了卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP对BH3模拟物S1的敏感性。 4.抑制JNK3通过阻断细胞自噬通量从而提高了卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP对BH3模拟物S1的敏感性。本文首次探讨了JNK家族的亚型JNK3在卵巢癌细胞耐药中的作用，JNK3可能通过减少氧化损伤和激活自噬途径发挥了促进细胞存活的作用。因此JNK3可能是逆转肿瘤细胞耐药的一个潜在靶标。
【图文】：

家族,蛋白,Bcl-2家族蛋白,Bcl-2家族

图 1.1 Bcl-2家族蛋白调控细胞凋亡途径[30]第二种模式（间接活化模式）表明Bak不与任何BH3-only蛋白结合，并且Bax和Bak在未与公认的BH3-only活化因子（Bim，Bid）结合的情况下，甚至是缺乏Bim或Bid、Puma减少的情况下仍可以诱导凋亡[31]。虽然现在还需要进一步研究来阐明Bcl-2家族蛋白诱导凋亡的调控机制，充分理解Bcl-2的生物途径，但是靶向Bcl-2家族蛋白的药物已经进入肿瘤学临床试验。不同于大部分促进增殖的致癌基因，Bcl-2通过抵抗程序性细胞死亡来发挥其功能[32]。由于Bcl-2家族抗凋亡蛋白通过抵抗凋亡促进细胞存活，并且在癌细胞中抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白可以诱导显著的凋亡现象[33]，这就为我们提供了治疗靶点。因为在85%的滤泡性淋巴瘤和20%的弥散性B细胞淋巴瘤中存在特异性的Bcl-2染色体异位t（14,18），这就导致了Bcl-2基因表达在转录水平失调[34]。最初对Bcl-2生物效应的体内研究是在Bcl-2转基因小鼠中进行的，可以发现在转基因小鼠中Bcl-2的过表达集中于B和T淋巴细胞中，导致了滤泡增殖或者T细胞

示意图,直接活化,模式,示意图

淋巴瘤[35]。图1.2 直接活化和间接活化模式示意图[36]通常，高水平的Bcl-2和Bcl-XL与恶性表型和多种恶性血液病以及实体瘤的化疗药物的耐药密切相关[37]。譬如，前列腺癌中高水平Bcl-2与高Gleason分级以及前列腺切除术后高复发比率相关[38]。NCI60细胞系Bcl-XL的表达与多种化疗药物的耐药密切相关，有关卵巢癌A2780及SKOV3细胞系的研究也得出相同结论[39-41]。研究发现在急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病中Bcl-2在RNA水平和/或蛋白水平是过表达的[42, 43]，而Bcl-2/Bax的比率与急性髓细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病的预后成负相关[44]。尽管体内实验表明调控Bcl-2可以增加癌症细胞对化疗药物的敏感性，但是Bcl-2的表达水平并不影响急性淋巴细胞性白血病的无事件生存率和肿瘤转移[45]，这可能是由于Bcl-2家族成员间存在复杂的交互作用。因此，我们推测，Bcl-2家族是通过调节促凋亡、抗凋亡蛋白间的平衡来调控癌症细胞死亡
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【参考文献】