TWEAK介导LPS对小鼠uNK细胞毒性的调节作用及分子机制

发布时间：2017-03-19 19:06

  本文关键词：TWEAK介导LPS对小鼠uNK细胞毒性的调节作用及分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：子宫NK细胞(uNK)是妊娠早期母胎界面数量最为丰富的淋巴细胞。uNK细胞与胎儿的血管形成以及免疫耐受密切相关,在正常妊娠建立与维持中发挥着重要作用。肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)通过与其受体纤维母细胞生长因子诱导分子14(Fn14)相互作用在肿瘤抑制、免疫系统的稳定和各种疾病的发病机制中起关键性的作用。为了研究妊娠早期子宫TWEAK/Fn14介导的天然免疫调节及潜在分子机制,本试验利用LPS诱导建立小鼠流产模型,采用HE染色观察流产小鼠子宫组织病理学形态,采用DBA染色方法检测uNK的动态分布变化,IHC方法确定TWEAK/Fn14的组织表达分布,IF法分别检测TWEAK/Fn14、NKG2D、TNFα与uNK细胞的共定位,Western Blot检测子宫组织中TWEAK/Fn14蛋白的表达变化。本研究同时利用免疫磁珠分选技术分离纯化uNK细胞后,通过荧光定量PCR及Western Blot方法研究TWEAK/Fn14对uNK细胞毒性及分泌活性的分子调节机制。研究结果如下:1.在怀孕后(GD)3天,每只小鼠尾静脉注射2 ug剂量的LPS,GD 9.5天小鼠发生流产。HE染色结果显示小鼠子宫组织出现充血水肿,炎性细胞浸润,组织坏死脱落,以及出血等病理学变化。采用DBA生物素标记检测发现,正常妊娠小鼠子宫内uNK细胞数量在妊娠中期(GD 9.5)急剧增加并达到最高,而LPS处理组uNK细胞数量显著低于正常对照组(P0.05)。利用IHC方法研究子宫TWEAK/Fn14组织分布,发现TWEAK主要分布于子宫固有层及腺体区,而Fn14主要表达于腔上皮和腺上皮细胞。在GD 9.5,LPS处理组小鼠子宫组织出现TWEAK弱染以及Fn14强染。Western Blot检测发现LPS处理组子宫组织TWEAK和Fn14蛋白表达水平与IHC检测结果基本一致。免疫荧光研究发现uNK细胞可同时表达TWEAK与Fn14,且TWEAK主要分泌于uNK细胞。同时,我们研究发现LPS处理组中TNFα+及NKG2D+uNK细胞所占总uNK细胞比例较正常受孕组显著增加(P0.05)。2.为进一步研究TWEAK/Fn14通路对LPS作用下uNK细胞毒性及分泌功能的调节机制,我们采用DBA生物素包被的磁珠分选技术,分离纯化了正常妊娠以及LPS处理组小鼠子宫uNK细胞,Western Blot和RT-PCR结果显示TWEAK在uNK细胞的表达水平与子宫组织中表达水平基本一致。相比于正常对照组,NKG2D和TNFα在LPS处理组小鼠uNK细胞中表达水平增加。为研究TWEAK对uNK细胞中NKG2D和TNFα表达水平的调节作用,我们使用重组TWEAK蛋白及TWEAK特异性抗体处理分离的uNK细胞。Western Blot检测发现添加不同浓度的重组TWEAK蛋白对uNK细胞中NKG2D及TNFα的表达水平作用不显著,而TWEAK特异性抗体作用于uNK细胞却导致剂量依赖性上调NKG2D及TNFα的表达。基于上述研究结果及相关研究报道,我们选择JAK2-STAT3信号通路进行分析,发现相比于对照组,WP1066抑制剂组,Anti-TWEAK抗体组,WP1066+Anti-TWEAK抗体组及WP1066+TWEAK重组蛋白组中pSTAT3的表达水平均显著降低(P0.05)。同时,Western Blot检测发现,pSTAT3的表达水平与NKG2D和TNFα的表达存在负反馈的调节作用。综上所述,本研究通过建立LPS诱导的流产小鼠和分离纯化小鼠uNK细胞,研究TWEAK介导LPS对uNK细胞的分泌活性和细胞毒性的调节作用及分子机制。阐明了LPS诱导流产发生的TWEAK/Fn14调节机制,即通过调节uNK细胞内源性TWEAK表达分泌水平,负调控STAT3的磷酸化水平,进而调控uNK细胞中活化性受体NKG2D及TNFα的表达水平,诱导妊娠小鼠流产的发生。
【关键词】：小鼠 LPS 流产 子宫NK细胞 TWEAK Fn14 细胞毒性功能
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 文献综述11-16
• 第一章 TWEAK及uNK与妊娠免疫耐受研究进展11-16
• 1.1 uNK细胞与妊娠免疫耐受11-13
• 1.1.1 uNK细胞命名及特征12
• 1.1.2 uNK细胞与pNK细胞12
• 1.1.3 uNK细胞在妊娠中的作用12-13
• 1.2 TWEAK/Fn14与妊娠免疫耐受研究进展13-15
• 1.2.1 TWEAK的发现、命名及结构13
• 1.2.2 TWEAK的分布及功能13-14
• 1.2.3 Fn14受体概述14-15
• 1.2.4 TWEAK与生殖免疫15
• 1.3 本研究的目的与意义15-16
• 试验研究16-38
• 第二章 LPS诱导的流产小鼠子宫中TWEAK /Fn14及uNK变化规律研究16-28
• 2.1 材料17-18
• 2.1.1 试验动物与取材17
• 2.1.2 主要试剂17-18
• 2.1.3 主要仪器18
• 2.2 方法18-20
• 2.2.1 子宫组织病理学观察18
• 2.2.2 DBA染色检测uNK细胞18-19
• 2.2.3 IHC检测子宫中TWEAK和Fn14分布表达19
• 2.2.4 Western Blot检测子宫中TWEAK和Fn14蛋白的表达19-20
• 2.2.5 免疫荧光法检测20
• 2.3 结果20-26
• 2.3.1 子宫组织病理学变化20-21
• 2.3.2 uNK细胞分布及数量变化21-22
• 2.3.3 子宫组织中TWEAK及Fn14分布表达变化22-23
• 2.3.4 子宫组织中TWEAK及Fn14蛋白表达23-24
• 2.3.5 子宫组织中TWEAK/uNK与Fn14/uNK的表达分布24-25
• 2.3.6 子宫组织中NKG2D/uNK与TNFα/uNK的表达分布25-26
• 2.4 讨论26-27
• 2.5 小结27-28
• 第三章 TWEAK/Fn14对uNK细胞毒性功能调节机制研究28-38
• 3.1 材料28-29
• 3.1.1 主要试剂28-29
• 3.1.2 主要仪器29
• 3.2 方法29-32
• 3.2.1 小鼠uNK细胞分离29-30
• 3.2.2 uNK细胞中TWEAK/Fn14的蛋白表达30
• 3.2.3 uNK细胞中TWEAK/ Fn14 mRNA变化30-32
• 3.2.4 uNK细胞中NKG2D与TNFα 表达32
• 3.2.5 重组蛋白TWEAK作用或其TWEAK特异性抗体封闭后uNK细胞中NKG2D与TNFα 表达32
• 3.2.6 JAK2-STAT3信号通路试验32
• 3.3 结果32-36
• 3.3.1 uNK细胞分离纯化32
• 3.3.2 小鼠uNK细胞中TWEAK及Fn14表达变化32-34
• 3.3.3 GD9.5 小鼠uNK细胞中NKG2D及TNFα 表达水平34
• 3.3.4 TWEAK及anti-TWEAK对小鼠uNK细胞毒性的影响34-35
• 3.3.5 JAK2-STAT3信号通路调节小鼠uNK细胞的毒性功能35-36
• 3.4 讨论36-37
• 3.5 小结37-38
• 结论38-39
• 参考文献39-46
• 附录46-47
• 缩略词表47-48
• 致谢48-49
• 作者简介49

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