EZH2调控BRCA1促进上皮性卵巢癌恶性生物学进展及上皮性卵巢癌石蜡标本实时定量PCR实验最适内参基因鉴定的研究

发布时间：2019-11-30 10:52

【摘要】：目的探讨在上皮性卵巢癌细胞中果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)能否调控乳腺癌第一易感基因(BRCA1)的表达及其调控机制,明确BRCA1在EZH2介导的卵巢癌恶性生物学进展中的作用,从而找到抑制肿瘤进展的靶点。方法构建两个靶向沉默EZH2基因的短发夹RNA (shEZH2)质粒表达载体,脂质体法稳定转染至上皮性卵巢癌细胞A2780,瞬时转染至ES2和SKOV3细胞。实时荧光定量PCR (qPCR)、免疫印迹和细胞免疫化学法检测下调EZH2后BRCA1在mRNA和蛋白水平的表达及细胞核内外分布情况。胰岛素样生长因子1(IGF-1)处理细胞活化AKT1,细胞免疫化学法再次检测EZH2和BRCA1的表达及核内外分布情况。化学合成三个靶向沉默BRCA1的小干扰RNA (siRNA),检验干扰效率后,脂质体法瞬时转染至转染了shEZH2和空白对照组细胞中,MTT、Transwell小室法和流式细胞仪分别检测下调BRCA1表达对EZH2沉默所引起的卵巢癌增殖、迁移和细胞周期改变的影响。在顺铂耐药细胞中联合或单独沉默EZH2和BRCA1的表达,MTT法检测各组细胞对顺铂敏感性的变化。结果 1、上皮性卵巢癌细胞A2780、ES2和SKOV3中成功抑制EZH2表达后,BRCA1在mRNA水平上表达较对照组下调,而在蛋白水平上明显升高,并且存在由胞浆向胞核转移的趋势。 2、在转染shEZH2的A2780细胞中成功激活AKT1表达阻断了BRCA1蛋白的胞浆胞核转移效应。 3、沉默EZH2的A2780和ES2细胞中联合敲出BRCA1基因后,细胞的增殖迁移能力较未联合敲出BRCA1基因组增强。 4、卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP中联合沉默EZH2与BRCA1表达未能叠加单独沉默二者产生的细胞顺铂增敏作用。结论上皮性卵巢癌细胞中EZH2能调控BRCA1的表达及胞浆/胞核转移,该调控能被活化的AKT1所阻断。BRCA1下调能部分逆转EZH2引起的卵巢癌恶性生物学行为,提示BRCA1在EZH2发挥原癌基因的作用中起重要作用。目的筛选上皮性卵巢癌石蜡标本实时荧光定量PCR实验最适内参基因。方法以real-time PCR和ovarian cancer两个关键词在Pubmed查得2010年1月到2013年3月共计128篇全文获取十二个常用的管家基因(ACTB, GAPDH,18S rRNA, GUSB, PPIA, PBGD, PUM1, TBP, HRPT1, RPLPO, RPL13A和B2M),收集上皮性卵巢组织标本(正常、良性、交界性和恶性)共计五十例,运用激光显微切割技术获取同质性上皮性卵巢组织用于后续研究。实时定量PCR所得实验数据用单因素方差分析或非参检验进行分析。NormFinder和geNorm两个软件进一步用于验证候选内参基因的稳定性和实用性。结果上皮细胞在正常卵巢组织中占很小比例。候选内参基因中ACTB, PPIA, RPL13A, RPLPO和TBP不受疾病进展影响而在正常、良性、交界性和恶性上皮标本中相对稳定表达,其中NormFinder和geNorm验证得出ACTB, PPIA, RPLPO和TBP的稳定组合,而最常用内参基因GAPDH在卵巢上皮细胞中的表达不稳定,在癌组织中的表达显著高于其他三类组织。结论在上皮性卵巢肿瘤研究中推荐同质性上皮组织的使用和实时定量PCR实验多个内参基因的联合运用,例如ACTB, PPIA, RPLPO和TBP。而GAPDH由于其表达的相对不稳定性不宜单独用作内参校正。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【共引文献】