神经胶质成熟因子γ在斑马鱼血管芽细胞迁移和卵巢癌侵袭转移中的作用及机制研究

发布时间：2019-12-02 12:31

【摘要】：卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势,死亡率一直占据妇科恶性肿瘤首位。卵巢癌以上皮性癌为主,起病隐匿,多数患者就诊时表现为腹水形成及腹腔内病灶播散,预后差。临床上虽经肿瘤细胞减灭术辅以联合化疗,但5年生存率仍徘徊在30%左右。卵巢癌高致死率的原因主要因为其广泛的腹腔转移特性。我们首次发现神经胶质成熟因子γ在上皮性卵巢癌中高表达,并与卵巢癌患者FIGO分期及化疗耐药相关。多元回归模型分析提示神经胶质成熟因子γ是预测卵巢癌患者无瘤生存期的独立因素。但神经胶质成熟因子γ基因具体的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用目前尚知之甚少。斑马鱼是当今功能基因组时代生命科学研究中重要的模式动物之一。因此我们借助斑马鱼在研究基因功能方面的优势,探索了神经胶质成熟因子γ的生物学功能,尝试为揭示其在卵巢癌生物学行为中的作用提供重要依据。研究应用整胚原位杂交和western blot检测神经胶质成熟因子p基因和神经胶质成熟因子γ基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达模式；基于共聚焦显微镜的转基因斑马鱼胚胎活体影像技术用于实时观察特定部位器官、组织的形态发育及细胞水平的运动行为；应用基于胚胎显微注射技术的morpholino进行基因敲除实验,体外转录mRNA进行表型拯救实验研究神经胶质成熟因子丫基因在血管芽细胞迁移中的作用；流式细胞术用于分选转基因斑马鱼胚胎血管内皮细胞；实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测神经胶质成熟因子基因γ可能下游基因表达水平变化。斑马鱼体内研究数据提示我们前期发现的在卵巢癌中高表达的神经胶质成熟因子γ可能参与了与细胞运动相关的生物学行为调控。因此,我们进一步通过划痕实验和transwell小室实验研究过表达及敲减神经胶质成熟因子γ后对卵巢癌细胞迁移侵袭能力的影响；荧光标记鬼笔环肽染色观察神经胶质成熟因子γ在卵巢癌细胞肌动蛋白纤维聚合解聚过程中的作用；最后免疫共沉淀用于寻找和验证可能与神经胶质成熟因子γ存在相互作用的蛋白分子。结果表明神经胶质成熟因子丫通过调控细胞肌动蛋白细胞骨架重塑增强了癌细胞迁移和侵袭能力,促进了卵巢癌病程进展。本研究为进一步深入研究神经胶质成熟因子γ在卵巢癌发生及病程进展中的作用及寻找卵巢癌阻遏新靶点提供了依据。第一部分斑马鱼神经胶质成熟因子丫在斑马鱼血管芽细胞迁移中的作用研究目的：克隆斑马鱼神经胶质成熟因子β基因和神经胶质成熟因子γ基因,明确它们在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,并阐明神经胶质成熟因子基因γ在斑马鱼胚胎血管芽细胞迁移过程中的作用。方法：整胚原位杂交和western blot用于检测神经胶质成熟因子基因β和神经胶质成熟因子基因γ在斑马鱼胚胎发育中的时空表达情况。应用基于胚胎显微注射技术的morpholino进行基因敲除实验,体外转录mRNA进行表型拯救实验。应用基于激光共聚焦显微镜的转基因斑马鱼胚胎活体影像技术实时观察特定部位器官、组织的形态发育及细胞水平的运动行为。流式细胞术用于分选转基因斑马鱼胚胎血管内皮细胞。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测神经胶质成熟因子基因γ可能下游基因表达水平变化。结果： 1.成功克隆了斑马鱼神经胶质成熟因子基因β和神经胶质成熟因子γ基因。 2.进化分析显示神经胶质成熟因子基因序列在脊椎动物中高度保守。 3.神经胶质成熟因子β和神经胶质成熟因子γ在斑马鱼胚胎发育过程中的基因表达模式不同。神经胶质成熟因子β主要表达在头部。神经胶质成熟因子γ富集于血管内皮细胞,并随心血管系统发育而呈现增强表达。 4.在斑马鱼受精卵中敲除神经胶质成熟因子γ引发血管芽细胞迁移障碍和血管发育表型缺陷。这种发育表型缺陷可以被共注射神经胶质成熟因子γ mRNA所部分拯救。 5.斑马鱼胚胎内皮细胞中神经胶质成熟因子γ调控STAT3、VEGFA、MMPs基因的表达。结论： 1.神经胶质成熟因子在斑马鱼胚胎发育过程中的表达具有时空特异性。 2.斑马鱼胚胎血管内皮细胞的神经胶质成熟因子丫表达对血管芽细胞迁移运动行为是必需的。第二部分神经胶质成熟因子γ在卵巢癌侵袭转移中的作用研究目的：确定神经胶质成熟因子γ对卵巢癌细胞运动行为的调控功能及机制,并阐明其在卵巢癌细胞迁移侵袭中的作用。方法：应用免疫组织化学方法检测卵巢正常上皮、卵巢腺瘤、卵巢交界性腺瘤及上皮性卵巢癌组织中神经胶质成熟因子丫的表达情况。western blot用于检测不同卵巢癌细胞株中神经胶质成熟因子Y的蛋白水平。通过划痕实验和transwell小室实验研究过表达及敲减神经胶质成熟因子丫在卵巢癌细胞迁移侵袭中的作用。荧光标记鬼笔环肽染色观察神经胶质成熟因子γ在卵巢癌细胞肌动蛋白纤维聚合解聚过程中的作用；最后免疫共沉淀用于寻找和验证可能与神经胶质成熟因子γ存在相互作用的蛋白分子。结果：1.神经胶质成熟因子丫在卵巢癌组织中的表达显著高于正常、腺瘤及交界性腺瘤组织。2.在低表达的卵巢癌细胞株中过表达外源性神经胶质成熟因子γ增强了卵巢癌细胞迁移侵袭能力。3.在高表达卵巢癌细胞中敲减内源性神经胶质成熟因子γ抑制了卵巢癌细胞迁移侵袭能力。4.卵巢癌细胞株中过表达神经胶质成熟因子γ后,细胞中密集网络样的肌动蛋白纤维呈现为细长纵行丝状。5.卵巢癌细胞中神经胶质成熟因子γ与Arp2/3复合物存在相互结合。结论： 1.卵巢癌中神经胶质成熟因子γ高表达与临床不良预后相关,可能是潜在的卵巢癌标记物。 2.神经胶质成熟因子丫可能通过调控肌动蛋白细胞骨架重塑而增强卵巢癌细胞侵袭转移能力。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.31

【共引文献】