P16基因启动子CpG岛甲基化与上皮性卵巢癌发病关系的研究

发布时间：2020-03-18 04:21

【摘要】：背景卵巢癌发病的病理过程错综复杂,目前发病机制尚不清楚。已有许多相关实验表明在卵巢癌中检测到不同基因不同程度的甲基化,并认为其与卵巢癌的发生密切相关。P16作为一种负向调节细胞周期的抑癌基因,当其启动子区域发生甲基化时,抑制该基因转录表达,造成细胞恶性增殖。有学者在卵巢癌中检测到P16基因发生了甲基化,并且认为这与卵巢癌的发生有一定的关系;而另有学者则通过荟萃分析认为P16基因的甲基化与卵巢癌的关系并不显著相关。目的本实验旨在研究P16基因启动子区域CpG岛在上皮性卵巢癌(EOC)组织样本中的甲基化改变,探究其与EOC发病的关系。方法收集住院病人诊断为EOC(III期)的卵巢组织样本13例(包括8例浆液性囊腺癌,1例黏液性囊腺癌,1例子宫内膜样癌),因子宫疾病行全子宫及双附件切除术的正常卵巢组织样本2例,术后均由病理科确诊;采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MS-PCR)测定样本中P16基因甲基化状态及评估PCR引物扩增的最适温度;运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术再次测定样本中甲基化状态,用克隆测序对PCR特异产物进行验证。结果1 MS-PCR方法检测P16基因甲基化状态1.1 P16基因启动子CpG岛甲基化在EOC和正常卵巢组织中发生率分别为69.2%(9/13)、50.0%(1/2),两者进行比较P0.05,差异无统计学意义;EOC中P16基因甲基化在浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌和子宫内膜样癌中发生率分别为72.7%(8/11)、100%(1/1)、0%(0/1),三种组织学类型之间进行比较,P0.05,差异无统计学意义;1.2实验组及对照组在退火温度60-56℃时电泳出特异性PCR产物的条带,低于54℃时出现非特异性产物的条带;2 qPCR方法检测P16基因甲基化状态P16基因启动子CpG岛甲基化在EOC和正常卵巢组织中发生率分别为0%(0/13)、0%(0/2),两者进行比较P0.05,差异无统计学意义。结论本实验所研究的P16基因启动子CpG岛未发生甲基化,暂不认为其与EOC的发病具有相关性。
【图文】：

结果1 DNA 纯度检测纳入研究组的 13 例样本及对照组的 2 例样本，微量紫外分光光度计读取 260nm和 280nm 波长处的光密度(optical density，OD)值， OD260/OD280 均在 1.7-1.9 之间。2 DNA 亚硫酸氢盐转化查询 NCBI 的 Genebank，版号 hg38 基因为 P16 基因组参考序列，具体如下图 2，图中 CpG 和 C2T 均为 P16 基因亚硫酸盐转化后的 DNA 序列，其中 CpG 序列是高度甲基化的，而 C2T 序列是非甲基化的，图中小写 t 为两者差异位点，标绿处为 P16探针识别位置。

ACTB-R CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAAACTB-P HEX-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BR 扩增及电泳成的引物进行梯度 PCR，电泳图显示退火温度为 60℃-56℃时，非卵织 bisDNA 显示有特异的扩增条带，，当退火温度低于 56℃时，均出现，且条带亮度强弱区别不显著，如图 3。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

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