Capn4在卵巢癌中的生物学功能及其对顺铂化疗敏感性影响的机制研究

发布时间：2020-03-20 19:18

【摘要】：卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤之一,因其起病较隐匿、转移性强、预后差,发病率和死亡率均位居妇科恶性肿瘤前列。近年来,随着卵巢癌的诊断和治疗方法的新进展使早期发现的患者长期存活率有了较明显改观。然而,由于卵巢癌临床症状不明显,大多数患者被诊断时已为已有卵巢癌盆腔转移或淋巴转移,患者预后极差,且死亡率高,5年生存率低于40%。目前,卵巢癌细胞减灭术及手术后辅以铂类药物联合紫杉醇为主的一线化疗是卵巢癌临床治疗的标准方案,但随着肿瘤药物化疗敏感性的降低及耐药情况增加,现行的卵巢癌临床化疗效果却不甚理想。尽管许多临床医生和研究学者都在寻求更有效的新治疗手段和治疗药物中进行了许多有益的探索和尝试,然而卵巢癌患者的生存率依然未获得有效改观。因此,在不同层面对卵巢癌发生发展进行相关研究,寻找到特异性强的基因靶点、有效的治疗手段和治疗药物迫在眉睫。钙蛋白酶(Calpains)是一种高度保守的钙依赖型非溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族,其选择性催化参与各种细胞过程(包括迁移、运动、增殖和凋亡)特异性底物蛋白的水解。目前,已有15种钙蛋白酶表型在哺乳动物中被鉴定。其中,Capn4作为钙蛋白酶蛋白水解系统中重要的小调节亚基,在维持钙蛋白酶-1(Calpain-1)和钙蛋白酶-2(Calpain-2)稳定性和活性中具有极其重要的作用。诸多研究证实钙蛋白酶在多种恶性肿瘤中高表达,且与肿瘤患者的恶性程度和预后关系密切。然而,在本研究实施前尚未见学者对Capn4在卵巢癌组织中的表达及其具体机制进行全面和深入的研究。无法了解Capn4在卵巢癌发生发展及预后中可能承担的角色,其是否可作为卵巢癌潜在的预后和早期诊断或早期治疗的基因靶点值得深入研究。因此,我们本研究目的旨在考察Capn4在卵巢癌组织中的表达情况,阐明Capn4表达与卵巢癌患者临床病理特征及患者预后的相关性,探讨其在卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭以及迁移中的作用及可能的分子机制,并进一步研究Capn4对卵巢癌顺铂化疗敏感性的影响及相关作用机制,以期明确Capn4在提高卵巢癌顺铂化疗药物的敏感性,改善患者预后的作用,最终为以Capn4的靶向治疗提供更多新的实验依据。第一部分Capn4在卵巢癌组织中的表达及其预后相关性研究目的:检测Capn4基因在卵巢癌组织中的表达水平,分析Capn4在卵巢癌组织中表达差异与卵巢癌患者临床病理特征之间的关系,并考察其与卵巢癌患者的预后相关性。方法:选择在南昌大学第一附属医院收治确诊并进行手术切除、病理诊断确诊为卵巢癌的组织标本113例作为研究组,癌旁正常组织35例作为对照组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western-blot及免疫组化的实验方法,分别检测Capn4的mRNA、蛋白的表达水平以及阳性表达情况;采用卡方检验方法分析Capn4表达与临床病理参数之间的相关性,并通过对入选卵巢癌患者进行5年总生存期随访;运用Kaplan-Meier生存曲线分析Capn4表达情况与无疾病进展生存期及总生存期之间的关系;运用单因素及多因素Cox回归分析方法确定Capn4表达能否作为卵巢癌患者总生存期预后的危险因素。结果:与癌旁正常组织比较,卵巢癌组织中Capn4的mRNA及蛋白表达水平均显著升高(p0.05),卵巢癌组织中高表达组Capn4表达显著高于低表达组(P=0.0054);卡方检验分析结果显示Capn4表达水平与卵巢癌患者临床病理参数FIGO分期、远处转移、肿瘤分级呈正相关(P0.05);Kaplan-Meier生存曲线分析证实Capn4表达与卵巢癌患者无疾病进展生存期及总生存期之间呈负相关,Capn4高表达的卵巢癌患者预后较差(P=0.006);Cox回归分析发现Capn4的表达可以作为卵巢癌患者预后的一个独立危险因素(HR=2.157,95%CI:1.091-3.138,P=0.014)。结论:Capn4在卵巢癌组织中异常表达与卵巢癌恶性程度成正相关,且与患者的不良预后关系密切,Capn4可作为卵巢癌患者预后的独立危险因素。第二部分Capn4对卵巢癌生物学行为的影响及机制研究目的:观察和评估Capn4对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、侵袭及迁移等生物学行为产生的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:采用qRT-PCR方法检测Capn4在不同级别的卵巢癌细胞(A278、SKOV3、OVCAR-3)与正常卵巢上皮细胞HOSEPIC的表达情况;采用瞬时转染技术干扰SKOV3、OVCAR-3细胞系中Capn4的表达,应用qRT-PCR、Western-blot方法检测稳定转染干扰RNA后Capn4在卵巢癌细胞中的干扰表达效率;运用MTS实验、克隆形成实验、细胞侵袭实验、划痕实验、流式细胞术等实验方法,检测卵巢癌细胞株中Capn4-siRNA瞬时干扰后Capn4的表达,分别观察和评价Capn4对卵巢癌细胞的增殖、侵袭以及迁移的影响;并进一步采用Western blot方法检测Capn4干扰表达后与细胞周期、凋亡、侵袭、迁移相关蛋白的表达情况,以探索其对生物学行为影响可能的分子机制。结果:与正常卵巢上皮细胞比较,在不同卵巢癌细胞(A278、SKOV3、OVCAR-3)中Capn4表达均显著升高(P0.05);在卵巢癌SKOV3、OVCAR-3细胞中瞬时转染干扰序列Capn4-siRNA后,与空白组比较,Capn4-siRNA组中Capn4表达显著下调(P0.05);体外细胞实验研究发现经瞬时转染Capn4-siRNA干扰序列后,Capn4抑制表达能显著降低卵巢癌细胞增殖和细胞克隆能力,并促进卵巢癌细胞的凋亡;Capn4抑制表达可降低卵巢癌细胞中细胞周期相关蛋白Cyclin-D1、CDK4、p-Rb的表达,使细胞周期阻滞在G0/G1。Capn4抑制表达可影响基质金属蛋白酶MMP2、MMP9以及上皮间质转化相关蛋白Vimentin、E-cadherin的表达,使卵巢癌细胞的上皮间质转化过程受阻,抑制其侵袭迁移。结论:Capn4在卵巢癌细胞中高表达;干扰Capn4的表达可显著降低卵巢癌细胞的增值、侵袭与迁移能力,促进细胞凋亡。第三部分Capn4影响卵巢癌顺铂化疗敏感性的研究目的:初步探讨Capn4表达对卵巢癌顺铂化疗敏感性的影响及其可能的作用机制。方法:运用siRNA瞬时干扰技术沉默卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR-3)中Capn4的表达,采用MTS实验方法检测并评估Capn4对卵巢癌中顺铂化疗敏感性,并使用流式细胞术对其结果进行验证;采用western-blot方法对Capn4影响顺铂在卵巢癌化疗药物敏感性的作用机制进行检测和初步探讨。结果:干扰卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR-3)中Capn4的表达后,和对照组相比,卵巢癌细胞增殖能力显著下降,顺铂的IC50值明显降低,差异具有显著性(P0.05)。随后的流式细胞术检测结果显示,相对于对照组,Capn4抑制表达后顺铂导致的卵巢癌细胞凋亡数目明显的增加;此外,顺铂对Capn4的表达呈现浓度和时间双重依赖性。Capn4抑制可导致凋亡相关蛋白Caspase-3及Bax蛋白的上调表达,Bcl-2及核苷酸切除修复相关蛋白ERCC1的表达降低,从而提高了顺铂在卵巢癌细胞中的化疗敏感性。结论:Capn4抑制表达可提高顺铂在卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR-3)中的药物敏感性,其可能的作用机制是通过Capn4的表达影响肿瘤细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2及核苷酸切除修复相关蛋白ERCC1表达。
【图文】：

钙蛋白酶,卵巢癌

诸多的研究结果提示钙蛋白酶异常活化可能是导致肿瘤发生及发展的重要特征，基于 Capn4 作为钙蛋白酶家族重要成员在调节肿瘤发生发展中扮演的重要角色，我们有理由相信 Capn4 具有成为恶性肿瘤诊断及基因治疗中一个重要的新型预测肿瘤预后分子标记物的潜质。因此，大量 Capn4 与肿瘤相关的研究工作为本研究探讨 Capn4 与卵巢癌之间相关性的创新性研究设计提供了丰富的理论依据，并为卵巢癌可能的新治疗靶点的发现提供了新的研究思路及实施的可行性。因此，本研究主要分为三个研究部分，从不同层面围绕 Capn4 与卵巢癌之间的关系开展研究设计和实施，第一部分我们拟使用荧光实时定量 PCR、Western-Blot 及免疫组化方法，，检测卵巢癌患者术后卵巢癌组织标本中 Capn4的表达，初步探讨 Capn4 表达与卵巢癌患者的临床病理特征和预后的相关性，从整体层面证实 Capn4 是否可作为卵巢癌预后的一个独立危险因素。第二部分从细胞分子层面检测卵巢癌细胞中 Capn4 的表达，通过运用 RNA 干扰技术瞬时转染 siRNA-Capn4 干扰卵巢癌细胞中 Capn4 的表达后，分别采用 MTS 实验、平板克隆形成、划痕实验、Transwell、细胞周期分析等实验方法探讨 Capn4 干扰表达后对卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移、细胞周期及凋亡的影响，并考察其可

卵巢癌,高级别,卵巢癌组织,对照组

15图 1-1 Capn4 在卵巢癌与癌旁正常组织中 mRNA 的表达组织与癌旁正常组织中 Capn4 的 mRNA 表达水平差异显著(* p < 0.01)；O 分期 Capn4 的 mRNA 表达，高级别组、低级别分别与对照组 Capn4 的高（高级别组 VS 低级别组、对照组，P < 0.01；低级别组 VS 对照组，n4 表达水平与卵巢癌患者临床病理因素的相关性分析卵巢癌组织中 Capn4 的 mRNA 表达量将卵巢癌组织标本进n4低表达组和Capn4高表达组，采用卡方检验方法分析Capn4 与卵巢癌患者临床病理参数之间的关联性。结果显示，Capn4 FIGO 分期、远处转移、肿瘤分级存在正相关（P < 0.05），度越高，Capn4 的表达越高。而 Capn4 的表达与患者年龄、大小相关性不大，结果如表 1-6 所示。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31

【参考文献】