先天性肾积水肾脏AQP1-3的表达及EPO对其调控机制研究

发布时间：2020-03-26 12:19

【摘要】：背景和目的先天性肾积水(congential hydronephrosis,CHN)是产前超声检查最常见的发育畸形之一,其发生率为新生儿的1-5%。CHN的临床病因很多,从子宫内短暂的生理性肾积水到临床上显著的肾脏和泌尿道先天性发育异常,但临床上最常见的病理性肾积水病因是肾盂输尿管连接处梗阻(pelvic-ureteric junction obstruction,PUJO),发病率为0.1%,占重度肾积水病例的50%,也是引起婴幼儿和儿童终末期肾功能衰竭的常见原因。由于CHN的病理生理机制及其转归仍不完全清楚,人们对先天性PUJO导致的肾积水患儿的治疗和后续管理还存在争议。由于CHN发生于胚胎时期,目前人们最早只能通过影像学检查对发育过程中胎儿肾脏的形态及血流动力学方面进行监测,但实际上肾脏的大体功能以及细胞和分子改变远远早于形态学变化,而CHN的转归及治疗方案的选择很大程度取决于胎儿时期的肾功能的情况。因此对于人胚胎时期肾脏发育过程中病理生理变化规律的探索有助于围产期及儿科医师对CHN患儿制定出更加合理的治疗方案。然而由于临床收集胎儿肾脏标本难度较大使相关研究很难进行,目前,人胚胎时期肾脏发育过程中包括正常及病理状态下功能相关的研究几乎空白,因此如何对肾积水胎儿肾脏功能变化进行预测或检查是临床急需解决的课题。尿液浓缩与水重吸收功能障碍是肾积水肾脏早期的功能变化,文献报道水通道蛋白1-3(aquaporin1-3,AQP1-3)表达下调与上述变化有关。AQP1是最早发现的水通道蛋白,主要位于肾脏近端小管和髓袢降支细段的顶质膜和基底膜上,其在近端肾单位重吸收水分和尿液浓缩中起重要作用;AQP2主要位于肾脏集合管主细胞的顶质膜和胞浆内囊泡中,是集合管水分重吸收的重要物质;AQP3位于集合管主细胞基底侧膜上,对于水分的重吸收和产生浓缩尿液也有一定的作用。前期对儿童肾积水肾脏的研究显示,肾积水时肾脏AQP1-3表达均下调,并且AQP1-3的表达下调是肾脏水分重吸收和尿液浓缩功能受损的主要原因。长时间大量稀释尿液的产生容易发生电解质平衡紊乱,因此肾脏AQP1-3的正常表达对机体水代谢平衡的维持非常重要。动物胎儿期肾脏水通道蛋白AQP1-3表达的研究已有文献报道,随着胎儿肾脏的发育,AQP1-3的表达越来越明显。但是,由于胎儿时期在宫内发育的特殊性,在临床上不能直接检测胎儿肾脏中AQPs的表达,因此前期关于人胎儿肾脏中AQPs表达规律的研究几乎没有报道。人体AQP2与其它亚型的水通道蛋白不同,其主要位于肾脏集合管上皮细胞,在肾脏组织中特异性表达。前期研究发现大约3%的肾脏AQP2可以随脱落的集合管上皮细胞进入尿液排出体外,并且随尿液排出的AQP2的比例不受人体生理状态的影响,这提示尿液中的AQP2可以反映肾脏AQP2的表达水平。另有研究发现CHN儿童尿液中AQP2的水平与肾积水的严重程度及肾脏浓缩尿液的功能有显著相关性,这说明患者尿液中的AQP2可以间接反映肾脏积水的严重程度及尿液浓缩功能。到妊娠中后期,胎儿尿液是羊水的主要来源,AQP2具有肾脏组织特异性,故羊水中的AQP2蛋白只能来源于胎儿肾脏,检测羊水的AQP2能反映出肾积水的严重程度及肾脏浓缩尿液功能。但是目前有关胎儿羊水中AQP2含量与胎儿肾脏中AQP2的表达情况的关系尚未见报道。羊水穿刺目前在临床上是一项成熟的有创检查,随着计划生育二胎政策的实施,越来越多的高龄产妇接受了行羊膜腔穿刺进行产前筛查,这为通过羊水检测AQP2提供了可能。因此本研究的第一和第二部分首先探讨了人发育过程中正常及肾积水胎儿肾脏AQP1-3的表达规律及羊水中的AQP2与胎儿肾脏中的AQP2蛋白表达之间的关系,为临床上早期对肾积水胎儿肾脏功能变化进行预测或检查提供参考。临床上对于CHN患者的治疗和管理方案的选择仍存在争议,多数临床指南建议如下:对于轻度CHN患者行保守观察治疗,PUJO导致的中重度CHN患者往往需要外科手术解除梗阻。但是前期较多的研究发现对于肾积水肾脏即使早期手术解除梗阻,肾脏浓缩尿液的功能仍不能完全恢复,并且仍会有持续的大量稀释尿液产生,这主要与梗阻解除后肾脏AQP2蛋白表达未能恢复正常有关。因此前期很多学者针对梗阻及梗阻解除后患者肾脏浓缩功能的治疗进行了较多的探索,但是目前仍未找到理想的预防CHN婴幼儿患者AQP2下调的方法。他丁类及沙坦类药物能够防止梗阻造成的AQP2下调,促进梗阻解除后AQP2蛋白表达及肾脏尿液浓缩功能的恢复,但此类药物可能会加重梗阻造成的婴幼儿肾脏损伤,限制了其临床应用。近年来,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对受损肾脏功能的保护作用的报道引起了大家的关注。任川等也发现EPO能促进幼鼠输尿管梗阻解除后AQP2蛋白及肾脏功能的恢复。但是EPO调节AQP2的具体机制,以及其是否可以促进梗阻解除后AQP1和AQP3蛋白的表达以及肾脏水分重吸收功能的恢复尚未见文献报道。目前,EPO已经在临床上用于治疗新生儿缺血缺氧性脑病,EPO是否可以用于CHN患儿以保护患者肾功能需要进一步研究。为了更好的从分子水平上了解CHN相关的肾脏病理生理学变化和转归及对可能的治疗方法的探索,常需要借助动物实验研究,大鼠输尿管梗阻模型已经广泛用于梗阻性肾病及肾间质纤维化等方面的研究。临床上的CHN患儿多数是部分梗阻,但是在动物模型中部分梗阻程度的均一性不容易控制和量化。输尿管完全梗阻模型可以克服这些困难,也常被用来研究梗阻引起的肾脏病理生理变化。因此本研究的第三部分用幼鼠输尿管完全梗阻模型探讨了EPO对输尿管梗阻解除后幼鼠肾脏AQP1-3表达及肾脏功能的影响,并探讨其发挥作用的机制。在肾脏表达的AQP的亚型中,AQP2与尿液浓缩功能的关系最为最为密切,并且与多种尿液浓缩稀释功能障碍有关,前期也有研究者发现EPO可以促进梗阻解除后大鼠肾脏AQP2表达的恢复,但是体内影响因素较多,EPO对肾脏集合管细胞中的AQP2直接调控作用及其发挥作用的机制还不清楚。体外研究可以排除体内其他因素的干扰,如果在体外EPO能直接上调AQP2的表达,则可能为EPO治疗AQP2相关的包括先天性肾积水等疾病提供理论依据。因此本研究的第四部分采用m IMCD-3细胞系,探讨EPO对集合管细胞中AQP2表达的作用及其机制。综上所述,本研究主要阐明肾脏水通道蛋白在先天性肾积水肾脏中的表达及EPO对其调控机制,通过临床上检测胚胎时期肾脏中的水通道蛋白正常和异常表达规律,在动物模型和体外实验证实EPO对输尿管梗阻肾脏AQP1-3蛋白表达的调控机制和肾脏功能的保护作用,主要研究目的和内容如下:(1)了解正常和积水肾脏的AQP1-3的表达情况;(2)了解羊水中检测到的AQP2和胎儿肾脏AQP2表达的关系;(3)在幼鼠探讨EPO对输尿管梗阻解除后幼鼠肾脏AQP1-3表达及肾功能的影响,并探讨其发挥作用的机制;(4)探讨EPO对m IMCD-3细胞AQP2表达的影响及作用机制。第一部分正常及肾积水人胎儿肾脏AQP1-3的表达材料和方法1.收集引产的正常胎儿肾脏共22例(15-21W组8例;23-28W组8例:30-36W组6例);2.收集引产的肾积水胎儿肾脏7例(32W 4例,34W 3例,病变部位均为单侧),取标本前泌尿系彩超发现胎儿肾脏重度积水;3.阳性对照:正常成人肾组织8例(男6例,女2例,年龄56±4.3岁)来自肾切除经手术后病理证实的肾盂癌旁的正常肾组织;4.利用HE染色技术检测胎儿肾脏的形态学变化;利用免疫组织化学技术检测所有肾组织中AQP1-3蛋白的定位与表达量;利用Real-time PCR技术检测所有肾组织中AQP1-3 m RNA的表达;利用Western blot技术检测所有肾组织中AQP1-3蛋白的表达量;5.统计学处理:采用SPSS21.0统计学软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示。两组之间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上的比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1.HE染色结果显示在妊娠早中期,胎儿肾脏皮质部分较少,并且皮质中肾小球数量较少,体积较大,随着胎龄的增加,肾脏皮质部分逐渐发育,皮质中肾小球数量也逐渐增多;在妊娠早中期,胎儿肾髓质中所含肾间质组织较多,肾小管稀少,随着胎龄的增加,肾单位逐渐发育,髓质中的肾小管和毛细血管逐渐增加。2.免疫组化结果显示胎儿肾脏中AQP1-3蛋白表达部位与成人相同,AQP1主要位于肾脏近曲小管和髓袢降支细段,在肾小球毛细血管内皮细胞也有表达,AQP2主要位于肾脏集合管主细胞顶端膜;AQP3主要位于肾脏集合管细胞基底侧膜。随着胎龄的增加,阳性表达AQP1-3的肾小管数量逐渐增加,表达强度也逐渐增强,但是在妊娠后期胎儿肾脏AQP1-3的表达强度均弱于成人肾组织。孕晚期肾积水组胎儿肾脏中AQP1-3蛋白的阳性表达程度弱于同孕期正常胎儿肾脏中AQP1-3蛋白的表达。3.RT-PCR结果显示随着胎龄增加,肾组织中AQP1-3的m RNA表达量逐渐增高;15-21W组,23-28W组和30-36W组胎儿肾组织中AQP1-3 m RNA的表达量分别为:AQP1:(13.4±7.3)%Vs.(31.7±5.7)%Vs.(71.1±1.9)%;AQP2:(12.0±2.3)%Vs.(32.2±4.3)%Vs.(78.6±5.6)%;AQP3:(16.1±6.3)%Vs.(47.2±6.3)%Vs.(81.5±3.1)%;P0.05。RT-PCR结果同时显示孕晚期肾积水胎儿肾脏中AQP1-3 m RNA的表达量均低于正常胎儿肾脏组:AQP1:(38.3±7.5)%Vs.(70.8±6.2)%;AQP2:(41.2±6.3)%Vs.(76.9±4.3)%;AQP3:(63.6±8.7)%Vs.(81.1±4.6)%;P0.05。4.Western blot结果同样显示随着胎龄增加,肾组织中AQP1-3的蛋白表达量逐渐增高;15-21W组,23-28W组和30-36W组胎儿肾组织中AQP1-3蛋白的表达量如下:AQP1:0.228±0.10Vs.0.304±0.091Vs.0.543±0.095;AQP2:0.157±0.086Vs.0.269±0.079Vs.0.441±0.011;AQP3:0.152±0.047Vs.0.261±0.086Vs.0.512±0.089;P0.05。Western blot结果同时显示孕晚期肾积水胎儿肾脏中AQP1-3蛋白的表达量均低于正常胎儿肾脏组:AQP1:0.281±0.039 Vs.0.449±0.039;AQP2:0.306±0.112Vs.0.567±0.142;AQP3:0.261±0.086 Vs.0.512±0.089;P0.05。第二部分孕期羊水中AQP2与胎儿肾脏中AQP2蛋白表达的关系研究材料和方法1.收集正常胎儿肾脏标本22例(16-21W 8例,24-30W 8例,32-38W 6例)。2.收集正常胎儿羊水24例(16-21W 10例,24-30W 6例,32-38W 8例);同时收集10例健康成年女性(26.0±2.3岁)的晨尿作为阳性对照。3.用Western blot检测胎儿肾脏中的AQP2蛋白表达量,用酶联免疫吸附法检测羊水中的AQP2,用冰点渗透压测定仪检测羊水渗透压;用全自动生化检测仪检测羊水中的钠,钾及肌酐和尿素氮浓度。4.统计学处理:采用SPSS21.0软件进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示;正态性检验用K-S检验,多组间比较用单因素方差分析,各组之间的两两比较用LSD-t进行检验,羊水和肾脏中AQP2的关系用Pearson相关性分析进行检验,以α=0.05为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1.Western blot结果显示16-21W,24-30W和32-38W胎儿肾脏AQP2蛋白的表达量分别为0.982±0.325Vs.1.556±0.262 Vs.2.06±0.228,组间比较有统计学差异(P0.05);2.ELISA结果显示16-21W,24-30W和32-38W羊水及成人尿液中检测到的AQP2浓度分别为(30.243±5.812)mg/L Vs.(35.112±7.265)mg/L Vs.(42.575±1.226)mg/L Vs.(46.513±0.449)mg/L,组间比较有统计学差异(P0.05);3.相关性分析发现,不同孕期羊水中AQP2的水平与对应孕期胎儿肾脏中AQP2的表达呈正相关(r=0.872,P=0.000)。第三部分EPO对幼鼠双侧输尿管梗阻解除后肾功能及肾脏AQP1-3蛋白表达的影响材料和方法1.实验分组:(1)雄性SD幼鼠20只,体重(160±10)g,随机分为BUO组和sham组,各组n=10。(2)雄性SD幼鼠30只,体重(160±10)g,随机分为BUO-3R组、BUO-3R+EPO组和sham-3R组,各组n=10。(3)雄性SD幼鼠30只,体重(160±10)g,随机分为BUO-7R组、BUO-7R+EPO组和sham-7R组,各组n=10。2.动物模型制作:BUO大鼠的制作,待大鼠完全麻醉后,分别暴露出两侧输尿管并在跨过髂血管处钝性分离出一段长约1cm的输尿管,将一段侧方有开口的长约0.5cm的静脉输液针软管套于分离出的输尿管上,并用丝线结扎套管。BUO-R大鼠在梗阻术后24h再次麻醉,将两侧输尿管结扎的丝线和套管去除。Sham组大鼠仅游离两侧输尿管,但不结扎,其他处理同BUO及BUO-R组大鼠。3.药物干预:BUO-3R+EPO组大鼠在解除梗阻时及解除梗阻后的第1d和3d时给予EPO腹腔注射;BUO-7R+EPO组大鼠在解除梗阻时及解除梗阻后的第1d,3d,5d和7d时给予EPO腹腔注射,BUO-3R,Sham-3R,BUO-7R和Sham-7R组在相同时间点给予腹腔注射等体积的生理盐水。4.标本收集:BUO组大鼠在梗阻术后24h取标本;BUO-3R,BUO-3R+EPO和Sham-3R组大鼠在梗阻解除后的第3天取标本;BUO-7R,BUO-7R+EPO和Sham-7R组大鼠在梗阻解除后的第7天取标本。取标本时,经下腔静脉采血,用于肾功能的检测;然后取两侧肾脏,每个时间点取10只大鼠,各5只大鼠肾脏用于后续AQP1-3和α-SMA和TGF-?蛋白的western blot检测;另5只大鼠肾脏用于Masson染色和AQP1-3及α-SMA和TGF-?的免疫组化检测。5.统计学处理:应用SPSS21.0统计学软件进行数据处理分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两组之间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1.双侧输尿管完全梗阻24h后BUO组和sham组的肾功能检测结果如下(尿素氮:117.9±3.0 mmol/L Vs.6.9±0.2 mmol/L;肌酐:230±14.7μmol/L Vs.54.3±1.1μmol/L;血浆渗透压:338.8±3.2 mosmol/kg H2O Vs.293.7±5.2mosmol/kg H2O;血钾:6.5±0.3 mmol/L Vs.4.4±0.2 mmol/L;差异均有统计学意义,P0.05)。梗阻解除后的1W内大鼠会有明显的多尿,并且尿液渗透压较低。2.肾功能检测结果显示在梗阻解除后的第3天,BUO-3R+EPO组,BUO-3R组和Sham-3R组大鼠肾功能检测结果如下:尿素氮:21.9±1.1 mmol/LVs.27.1±2.1mmol/L Vs.6.8±0.3mmol/L,P0.05;血肌酐:113.4±3.3μmol/L Vs.134.2±5.4μmol/L Vs.54.1±1.4μmol/L,P0.05;肾功能检测结果显示在梗阻解除后的第7天,BUO-7R+EPO组,BUO-7R组和Sham-7R组大鼠肾功能检测结果如下,尿素氮:19.8±1.0 mmol/L Vs.22.9±0.8 mmol/L Vs.6.8±0.2 mmol/L,P0.05;血肌酐:67.7±3.2μmol/L Vs.74.1±3.1μmol/L Vs.54.2±0.7μmol/L,P0.05。3.免疫组化结果显示大鼠肾脏中AQP1主要位于肾脏近曲小管和髓袢降支细段,AQP2主要位于肾脏集合管主细胞顶端膜;AQP3主要位于肾脏集合管细胞基底侧膜。在梗阻解除后的第3d,AQP1,AQP2和AQP3的蛋白染色均为Sham-3R组最强,BUO-3R+EPO组次之,BUO-3R组最弱;在梗阻解除后的第7d,AQP1,AQP2和AQP3的蛋白染色也均为Sham-7R组最强,BUO-7R+EPO组次之,BUO-7R组最弱。免疫组化结果显示在梗阻解除后的第3d,TGF-?和α-SMA的蛋白染色均为,BUO-3R组最强,BUO-3R+EPO组次之,Sham-3R组最弱;在梗阻解除后的第7d,TGF-?和α-SMA的蛋白染色均为BUO-7R组最强,BUO-7R+EPO组次之,Sham-7R组最弱。4.Masson结果显示,在梗阻解除后的第3d,实验大鼠肾脏中胶原染色BUO-3R组最强,BUO-3R+EPO组次之,Sham-3R组大鼠最弱;在梗阻解除后的第7d,实验大鼠肾脏中胶原染色BUO-7R组最强,BUO-7R+EPO组次之,Sham-7R组最弱。5.Western blot结果显示在梗阻解除后的第3d,BUO-3R+EPO组,BUO-3R组和Sham-3R组大鼠的AQP1,AQP2和AQP3以及TGF-?和α-SMA的表达量分别为,AQP1:(60.1±5.8)%Vs.(35.3±6.3)%Vs.(100±6.6)%;AQP2:(59±7)%Vs.(32±8)%Vs.(100±9)%;AQP3:(62±6.7)%Vs.(48.5±2.2)%Vs.(100±5.9)%;TGF-?1:(109.4±4.4)%Vs.(141.7±5.5)%Vs.(100±3.9)%;α-SMA:(118.6±5.6)%Vs.(132.4±4.2)%Vs.(100±3.1)%,P0.05。Western blot结果显示在梗阻解除后的第7d,BUO-7R+EPO组,BUO-7R组和Sham-7R组大鼠的AQP1,AQP2和AQP3以及TGF-?1和α-SMA的表达量分别为,AQP1:(87.8±7.3)%Vs.(41.1±5.6)%Vs.(100±2.3)%;AQP2:(81.8±4)%Vs.(41.1±7)%Vs.(100±3)%;AQP3:(96.7±6.8)%Vs.(49.5±5.1)%Vs.(100±7.4)%;TGF-?:(147.3±2.3)%Vs.(321.3±13.1)%Vs.(100±2.7)%;α-SMA:(158.2±7.5)%Vs.(319.5±8.2)%Vs.(100±4.6)%,P0.05。第四部分EPO通过PI3K/AKT上调m IMCD-3细胞中AQP2表达材料和方法1.制作转染AQP2基因的m IMCD-3细胞系。2.取转染过AQP2的m IMCD-3细胞进行培养,调整细胞密度为3×106/ml,每孔加入2ml细胞悬液,均匀铺在6孔板中,待细胞贴壁后,饥饿24h,然后加入新的培养基,在DMEM培养基中根据分组分别加入0 IU/ml、5 IU/ml、10 IU/ml、20 IU/ml的EPO,每组处理5个重复,将培养板置于5%CO2的37℃培养箱中进行培养,培养72h后进行免疫荧光和Western blot实验检测不同浓度的EPO干预对AQP2蛋白表达的影响。3.取转染过AQP2的m IMCD-3细胞进行培养,调整细胞密度为3×106/ml,每孔加入2ml细胞悬液,均匀铺在6孔板中,待细胞贴壁后,饥饿24h,然后加入新的培养基,在DMEM培养基中根据分组分别加入10 IU/ml的EPO,每组处理5个重复,将培养板置于5%CO2的37℃培养箱中进行培养,分别在培养0’,5’,10’,15’,30’,1h,2h,3h,4h和5h组后提取蛋白进行Western blot实验检测EPO激活PI3K/AKT通路的最佳时间。4.取转染过AQP2m IMCD-3细胞进行培养,调整细胞密度为3×106/ml,每孔加入2ml细胞悬液,均匀铺在6孔板中,待细胞贴壁后,饥饿24h,然后加入新的培养基,按不同实验处理共分为4组,空白对照组,EPO组,EPO+LY294002组和LY294002组,每组处理5个重复,将培养板置于5%CO2的37℃培养箱中进行培养,分别在培养30min后提取蛋白进行Western blot实验检测PI3K/AKT信号通路激活情况。5.统计学处理:应用SPSS21.0统计学软件进行数据处理分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两组之间比较采用独立样本t检验,三组及三组以上比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准,P0.05为差异有统计学意义。结果1.免疫荧光结果显示,m IMCD-3细胞中AQP2蛋白主要位于细胞胞质内,EPO浓度为10IU/ml时AQP2染色最强。2.和免疫荧光结果一致,Western blot结果也显示,EPO浓度为10IU/ml时m IMCD-3细胞中AQP2蛋白表达最强;Western blot结果显示在EPO给药30min后,P-AKT表达量最高,Western blot结果显示在给药30min后,EPO+LY294002组的表达量较EPO组低,差异有统计学意义,P0.05。结论1.在发育过程中,人胎儿肾脏中的AQP1-3蛋白和m RNA均随胎龄增大,表达量也逐渐增加,其可能与胎儿肾功能逐渐发育成熟有关;胎儿时期肾积水会使胎儿肾脏中AQP1-3表达下调,这可能会影响胎儿肾脏尿液浓缩功能。2.羊水中检测到的AQP2蛋白浓度可以在一定程度上反应胎儿肾脏中AQP2蛋白的表达水平。3.EPO可以通过抗纤维化作用促进输尿管梗阻解除后幼鼠肾脏功能及肾脏AQP1-3蛋白表达的恢复。4.EPO通过PI3K/AKT信号通路上调m IMCD-3细胞中AQP2的表达。
【图文】：

胎儿肾,胎龄,HE染色,所指

胎龄16+1W胎儿肾组织HE染色结果

胎儿肾,胎龄,HE染色,所指

胎龄21+2W胎儿肾组织HE染色结果
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R714.5

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