CD147-Sp1关系环对卵巢癌细胞侵袭性影响的研究

发布时间：2017-03-23 15:18

  本文关键词：CD147-Sp1关系环对卵巢癌细胞侵袭性影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,发病率位于宫颈癌与子宫内膜癌之后,排名第三[1-3],其中上皮性肿瘤占原发性卵巢肿瘤的50%~70%,而恶性类型占卵巢癌的85%~90%[4]。多数卵巢癌病人由于早期缺乏明显的临床症状和高效的筛查技术,在发现时已为时已晚,并且期别也很高,也就促成了卵巢癌的治疗难度大、复发率高,5年生存率非常低的严峻形势[5]。CD147,又名EMMPRIN或Basigin,是一个高度糖基化的跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员[6-9]。CD147通过诱导基质金属蛋白酶(MMPs)分泌降解细胞外基质或通过上调VEGF表达、抑制凋亡等多种途径促进肿瘤侵袭转移[10-12]。CD147的高表达与卵巢癌的不良预后息息相关[13],作为一种重要的肿瘤标志物,阐明其表达调控机制对卵巢癌的诊断及治疗具有重要意义。孔等[14]的研究发现转录因子Sp1能直接与CD147启动子区特异结合并能有效启动其转录表达。此外,他们还发现CD147的低甲基化可以增加其与Sp1蛋白的亲和力,从而上调CD147表达。研究报道提示Sp1蛋白的磷酸化形式对于Sp1介导的基因转录激活作用具有重要意义[15]。Sp1的磷酸化形式或可增加其与DNA的结合能力,或可增加其蛋白的稳定性,或可影响它的转录活性。Tan等发现管紧张素Ⅱ激活PKC通路使Sp1的锌指结构域(Thr668,Ser670和Thr681位点)磷酸化,磷酸化后的Sp1与血小板衍生因子-D启动子的结合能力增加[16]。阻断JNK信号通路导致的Sp1在Thr278和Thr739位点的磷酸化,可以导致sp1的苏木素化,加速降解[17,18]。由于sp1的转录活性受到其与启动子的结合能力,蛋白的合成,核酸转运能力,与其它蛋白的相互作用以及蛋白的稳定性等多种因素影响,很难判断sp1的磷酸化对cd147转录活性的影响。本课题的研究目标有四点:首先明确sp1磷酸化是否参与cd147基因调控,其次探讨其具体调控机制[19],再次分析sp1磷酸化与cd147基因的相互作用对卵巢癌侵袭性的影响,最后分别在卵巢癌细胞及组织中分析sp1磷酸化与cd147表达的相关性[20]。第一部分:明确sp1磷酸化参与cd147基因表达调控。我们运用基因定点突变的方法构建了6个sp1磷酸化位点的突变体(thr355,thr453,th668,ser670,thr681,thr739)[21,22],将特定位点的丝?苏氨酸突变成谷氨酸,使其失去被磷酸化激活的功能。之后通过瞬时转染突变体和cd147启动子检测萤火虫荧光素酶强度发现sp1在thr453和thr739两个位点的突变可以显著降低sp1对cd147基因表达上调的作用[23]。在随后的实时定量pcr和westernblot的实验中也得到了验证。第二部分:探讨sp1磷酸化调控cd147基因表达机制。为了探讨sp1磷酸化参与cd147基因表达调控的具体机制,我们运用pi3k/akt和mapk/erk磷酸化通路特定抑制剂ly294002、雷帕霉素和pd98059预处理卵巢癌细胞后发现[24],sp1在thr453和thr739两个位点的磷酸化水平会随之下降,而总蛋白未见明显变化。此外,我们还发现cd147的蛋白水平也随之下降,提示通过pi3k/akt/mtor和mapk/erk途径可以激活sp1的磷酸化,而当sp1磷酸化水平受抑制时,cd147的表达水平也下降,提示sp1磷酸化对sp1激活cd147基因转录具有激活作用。而当我们上调或下调cd147的表达后,发现pakt,p70s6k和perk以及sp1在thr453和thr739两个位点的磷酸化水平均下降,而总蛋白均未见明显变化。综合第一部分实验,我们得知sp1在thr453和thr739位点的磷酸化可以增强sp1对cd147基因的转录激活作用,而在skov3细胞中过表达cd147基因后,sp1在thr453和thr739位点的磷酸化表达增加[25]。这是由于上游的pi3k/akt/mtor和mapk/erk通路被活化造成的。cd147-sp1关系环构成的正反馈环路可能成为解释cd147差异性表达的原因之一。第三部分:检测sp1磷酸化与cd147基因表达的相互作用对卵巢癌侵袭性的影响。用sp1(在thr453和thr739位点)磷酸化抗体和cd147单抗单独或联合封闭卵巢癌HO-8910细胞系的高转移株,Transwell实验发现卵巢癌细胞的侵袭性降低,提示Sp1-CD147关系环可以增加卵巢癌的侵袭性。第四部分:检测Sp1磷酸化与CD147基因在卵巢癌细胞及组织中的表达并分析其相关性。我们运用Western blot方法检测卵巢癌细胞株SKOV3、HO-8910和HO-8910PM中p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表达。结果显示在卵巢癌细胞中Sp1磷酸化蛋白水平和CD147蛋白在三种细胞系中的表达高低具有一致性。之后我们运用免疫组化的方法检测了53例卵巢癌标本中的p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表达和分布。结果显示Sp1的磷酸化蛋白主要表达于卵巢癌的细胞核膜和核内,而CD147主要表达于细胞膜和细胞浆中。CD147的表达情况统计结果示12例(强阳性,22.64%);15例(阳性,28.30%);6例(弱阳性,11.32%);20例(阴性,37.74%)Phospho-Sp1(T453)的表达情况统计结果示24例(强阳性,45.28%);13例(阳性,24.53%);7例(弱阳性,13.21%);9例(阴性,16.98%)而phospho-Sp1(T739)的表达情况统计结果示16例(强阳性,30.19%),14例(阳性,26.42%),10例(弱阳性,18.87%);13例(阴性,24.53%)。CD147阳性结果所占比例为62.26%,而phospho-Sp1(T453)和phospho-Sp1(T739)的阳性表达率分别为83.02%,75.47%。Spearman秩相关分析显示p-Sp1(Thr453)、p-Sp1(Thr739)和CD147的表达低度相关(rT453=0.477,P0.01;rT739=0.461,P0.01)。根据上述结果,我们明确了转录因子Sp1的磷酸化修饰与CD147基因表达的相互作用,并且发现Sp1-CD147正反馈关系环能促进卵巢癌细胞的侵袭性。这些结果有助于我们进一步了解卵巢癌中CD147基因高表达的发生机制,提示通过破坏Sp1-CD147正反馈关系环有助于卵巢癌的治疗。
【关键词】：卵巢癌 Sp1磷酸化 CD147 正反馈
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 缩略语表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-20
• 实验一 Sp1磷酸化参与CD147基因表达调控20-40
• 1 材料20-22
• 1.1 主要仪器20-21
• 1.2 细胞系和细胞株21
• 1.3 质粒21
• 1.4 主要试剂21-22
• 1.5 主要缓冲液22
• 2 方法22-32
• 2.1 细胞培养22
• 2.2 实验所需载体的扩增及保存22-24
• 2.3 构建Sp1磷酸化位点突变体24-26
• 2.4 双荧光素酶报告系统实验检测Sp1磷酸化对CD147的调控作用26-27
• 2.5 RT-PCR检测Sp1磷酸化对CD147表达水平的影响27-30
• 2.6 Western blot检测Sp1磷酸化对CD147表达水平的影响[98]30-32
• 2.7 数据的统计分析32
• 3 结果32-38
• 3.1 构建Sp1磷酸化位点突变体32
• 3.2 促进CD147表达的Sp1磷酸化位点的确定32-38
• 4 讨论38-40
• 实验二 CD147通过激活MAPK/ERK/mTOR和PI3K/AKT磷酸化通路促进Sp1磷酸化40-50
• 1 材料40-41
• 1.1 主要仪器40
• 1.2 细胞系和细胞株40
• 1.3 主要试剂40-41
• 1.4 主要缓冲液41
• 2 方法41-43
• 2.1 Western blot检测磷酸化通路抑制剂阻滞后Sp1磷酸化和CD147表达41-42
• 2.2 瞬时转染42
• 2.3 CD147干涉42
• 2.4 Western blot检测CD147对Sp1磷酸化表达的影响[98]42
• 2.5 数据的统计分析42-43
• 3 结果43-48
• 3.1 MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR磷酸化通路抑制剂下调Sp1磷酸化和CD147的蛋白表达43
• 3.2 上调CD147促进Sp1磷酸化表达43
• 3.3 干扰CD147抑制Sp1磷酸化表达43-44
• 3.4 CD147-Sp1关系环44-48
• 4 讨论48-50
• 实验三 CD147-Sp1关系环对卵巢癌细胞侵袭性的影响50-54
• 1 材料50
• 1.1 主要仪器50
• 1.2 细胞系和细胞株50
• 1.3 主要试剂50
• 2 方法50-51
• 2.1 Transwell实验检测CD147-Sp1关系环对卵巢癌细胞侵袭性的影响[13]50-51
• 2.2 数据的统计分析[13]51
• 3 结果51-53
• 3.1 CD147抗体封闭显著降低HO-8910PM的侵袭能力51-52
• 3.2 Sp1磷酸化抗体封闭显著降低HO-8910PM的侵袭能力52
• 3.3 CD147和Sp1磷酸化抗体联合封闭显著降低HO-8910PM的侵袭能力52-53
• 4 讨论53-54
• 实验四 CD147与Sp1磷酸化在卵巢癌中的表达相关性54-62
• 1 材料54-56
• 1.1 主要仪器54
• 1.2 细胞系和细胞株54
• 1.3 病理标本54-55
• 1.4 主要试剂55
• 1.5 主要缓冲液55-56
• 2 方法56-57
• 2.1 细胞培养56
• 2.2 Western blot检测卵巢癌细胞Sp1磷酸化和CD147蛋白表达56
• 2.3 免疫组化检测CD147与Sp1磷酸化在卵巢癌组织中的表达56-57
• 2.4 数据的统计分析57
• 3 结果57-61
• 3.1 CD147与Sp1磷酸化在卵巢癌细胞系中的表达正相关57
• 3.2 CD147与Sp1磷酸化在卵巢癌组织中的表达具有相关性57-61
• 4 讨论61-62
• 小结62-63
• 参考文献63-75
• 个人简历和研究成果75-77
• 致谢77-78

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