PLGA-DOTAP作为siRNA纳米递送载体用于RNA干扰子宫内膜异位症的研究

发布时间：2017-03-25 07:14

  本文关键词：PLGA-DOTAP作为siRNA纳米递送载体用于RNA干扰子宫内膜异位症的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的本研究欲探讨RNA干扰技术(RNAi)用于治疗子宫内膜异位症(EMs)的可能性,并首次评价PLGA-DOTAP/siRNA纳米微球作用于EMs间质细胞的安全性,递送siRNA至EMs间质细胞的可行性,siRNA在细胞内能否发挥生物学功能。为未来PLGA-DOTAP作为RNAi递送载体用于治疗EMs提供实验基础。方法1.标本采集:选取就诊于天津市中心妇产科医院并手术治疗的卵巢子宫内膜异位囊肿患者6例,术中取卵巢EMs病灶并原代培养EMs间质细胞。所有患者无内分泌、代谢性及免疫系统疾病,无恶性肿瘤史,6个月内无妊娠、哺乳及激素治疗史。2.实验方法2.1原代培养卵巢EMs间质细胞,并鉴定细胞。2.2制备PLGA-DOTAP纳米微球,透射电镜扫描结构。激光粒度仪检测粒径、Zeta电位。2.3琼脂糖凝胶电泳测定不同N/P比PLGA-DOTAP纳米微球包载siRNA的能力。2.4 CCK-8检测不同RNA终浓度、不同N/P比PLGA-DOTAP/siRNA对EMs间质细胞的毒性。2.5共聚焦显微镜检测PLGA-DOTAP/siRNA转染EMs间质细胞。2.6 PLGA-DOTAP/mi R-142-3p mimic转染EMs间质细胞,RT-PCR检测转染后6小时细胞内mi R-142-3p mimic含量,评估PLGA-DOTAP转染效率;RT-PCR检测转染后48小时细胞内gp130 mRNA表达差异。2.7 PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA转染EMs间质细胞,RT-PCR检测转染后48小时细胞内STAT3 m RNA表达改变。结果1.通过O/W乳化溶剂挥发法制备PLGA-DOTAP纳米微球,透射电子显微镜示PLGA-DOTAP复合物形成一类界线明显,粒子大小相似,具有核壳结构的球型粒子。Zeta电位为28.3±1.5mv,粒径为231.2±10.5nm。PLGA-DOTAP纳米微球大小较一致,相对稳定。2.PLGA-DOTAP与siRNA通过正负电荷结合,N/P比3:1时,PLGA-DOTAP与siRNA的结合效率低,当N/P比增大至6:1或更高时,PLGA-DOTAP能够较高效率结合siRNA。PLGA-DOTAP对EMs间质细胞有细胞毒性,毒性随PLGA-DOTAP用量增多而增大。当RNA终转染浓度为100nmol/L时,N/P比10:1和15:1的PLGA-DOTAP组细胞毒性小于Lipo组(P0.05)。当增加PLGA-DOTAP组RNA浓度至200nmol/L时,N/P比10:1和15:1的PLGA-DOTAP组细胞毒性增加,与100nmol/L RNA浓度的Lipo组无差别(P0.05)。共聚焦显微镜示PLGA-DOTAP/siRNA能够将siRNA递送入胞浆内,转染后细胞形态无明显改变。3.mi R-142-3p mimic转染后6小时,PLGA-DOTAP/mimic组和Lipo组EMs细胞内mi R-142-3p mimic含量均升高(P0.01)。随着PLGA-DOTAP/mimic用量增加,PLGA-DOTAP/mimic组细胞内mimic含量增加。当RNA转染浓度相同时,PLGA-DOTAP/mimic组细胞内mimic含量多于Lipo组(N/P比15:1组P0.05)。转染后48小时,PLGA-DOTAP/mimic组和Lipo组细胞内gp130 m RNA均下调(P0.05)。当RNA浓度为100nmol/L,PLGA-DOTAP/mimic组gp130 m RNA下调水平弱于Lipo组(P0.05)。增加PLGA-DOTAP/mimic组RNA浓度至200nmol/L,PLGA-DOTAP/mimic组gp130 m RNA下调程度能够达到甚至超过RNA浓度100nmol/L的Lipo组。4.STAT3 siRNA转染后48小时,PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA组和Lipo组细胞内均表达下调STAT3 m RNA。当RNA浓度100nmol/L,PLGA-DOTAP/STAT3siRNA组STAT3 m RNA下调水平弱于Lipo组(P0.05)。增加PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA组RNA浓度至200nmol/L,PLGA-DOTAP/STAT3siRNA组STAT3 m RNA下调程度能够达到甚至超过RNA浓度100nmol/L的Lipo组。结论1、PLGA-DOTAP自组装为纳米微球复合物,且较稳定,N/P比≥6:1时能够有效包载siRNA,形成PLGA-DOTAP/siRNA复合物。2、PLGA-DOTAP/siRNA能够顺利递送siRNA至EMs间质细胞内,PLGA-DOTAP在一定剂量内对EMs间质细胞损伤不大。3、PLGA-DOTAP/siRNA复合物向EMs间质细胞递送siRNA的效率高于Lipofectamine 2000试剂。4、PLGA-DOTAP/siRNA复合物向EMs间质细胞内递送的siRNA能够发挥生物学功能,作用特定靶mRNA,且能够缓慢控制释放siRNA。5、PLGA-DOTAP复合物作为递送材料用于EMs的RNAi治疗具有美好远景和广阔的发展空间,可在子宫内膜异位症的预防和治疗方面发挥作用。
【关键词】：子宫内膜异位症 RNA干扰 PLGA-DOTAP 递送载体 siRNA
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R711.71
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 缩略语11-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-15
• 研究目的、方法15-16
• 材料与方法16-33
• 1 材料16-19
• 1.1 研究病例16
• 1.2 实验材料16-18
• 1.3 主要实验仪器及耗材18-19
• 1.4 试剂配置19
• 2 方法19-33
• 2.1 PLGA-DOTAP/siRNA纳米微球的合成及表征19-21
• 2.2 卵巢子宫内膜异位囊肿间质细胞原代培养及鉴定21-23
• 2.3 PLGA-DOTAP/siRNA复合物对卵巢EMs间质细胞的细胞毒性检测23
• 2.4 共聚焦显微镜观察PLGA-DOTAP/FAM-N.C.siRNA纳米微球转染EMs间质细胞23-24
• 2.5 测定PLGA-DOTAP/miR1423p mimic对EMs间质细胞的转染效果24-30
• 2.6 测定PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA对卵巢EMs间质细胞的转染效果30-33
• 结果33-46
• 1 PLGA-DOTAP/siRNA纳米微球复合物的制备和表征33-37
• 2 卵巢EMs间质细胞原代培养及鉴定37-39
• 3 PLGA-DOTAP/siRNA对EMs间质细胞的毒性39-40
• 4 激光共聚焦显微镜测定PLGA-DOTAP/siRNA对EMs间质细胞的转染情况40-42
• 5 PLGA-DOTAP/miR1423p mimics转染EMs间质细胞对gp130 mRNA表达水平的影响42-44
• 6 PLGA-DOTAP/STAT3 siRNA转染EMs间质细胞对STAT3 mRNA表达水平的影响44-46
• 讨论46-55
• 1 子宫内膜异位症的发生发展46
• 2 EMs中microRNA的改变46-47
• 3 STAT3信号通路47-48
• 4 RNAi技术48-50
• 5 RNAi治疗子宫内膜异位症50-54
• 6 局限性及展望54-55
• 结论55-56
• 参考文献56-63
• 发表论文和参加科研情况说明63-64
• 综述 子宫内膜异位症中miRNA表达异常及RNA干扰技术的应用价值64-77
• 综述参考文献72-77
• 致谢77-79
• 个人简历79

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6 ;Synthesis of PLGA Labeled with ~(125)I[A];2006年上海市医用生物材料研讨会论文汇编[C];2006年

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