短尾蝮蛇毒解离素对大鼠实验性子宫内膜异位症的治疗作用及其机制研究

发布时间：2017-03-25 22:03

  本文关键词：短尾蝮蛇毒解离素对大鼠实验性子宫内膜异位症的治疗作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:子宫内膜异位症(Endometriosis,EMT)因具有异位种植生长和组织侵袭的能力,而被认为与恶性肿瘤生物学行为相似。其中子宫内膜细胞及血管内皮细胞的异位粘附、种植、生长是关键,因此有效地阻断该过程已成为治疗EMT的重要策略之一。整合素在细胞粘附、迁移、生长等过程中起着重要的作用,基质金属蛋白酶9(Matrixmetallo Proteinase-9,MMP-9)是细胞完成粘附、迁移和侵袭的生理或病理过程的关键物质,MMP-9可通过与整合素的相互活化而加强细胞间的粘附作用,还能促进新生血管形成。蛇毒解离素是整合素的拮抗剂,因含精-甘-天冬氨酸(RGD)序列可抑制整合素在细胞粘附、迁移等过程。故本文应用短尾蝮蛇毒解离素阻断大鼠子宫内膜细胞的异位迁移、粘附和侵袭,观察其对大鼠实验性EMT的疗效,并通过测定解离素对体外培养大鼠子宫内膜异位细胞及大鼠异位病灶MMP-9的表达研究其机制。以期阐释解离素治疗EMT的疗效和机制,为使之成为EMT新疗法提供实验依据。方法:1.短尾蝮蛇毒(Gloydius brevicaudus Venom,GBV)的分离纯化及活性鉴定1)Superdex 75凝胶过滤色谱:应用分子筛原理将蛋白质按分子量大小分离。2)DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析:利用阴离子交换原理将蛋白按不同等电点分离。3)SDS-PAGE检测蛋白纯度。4)Born法鉴定其抗血小板聚集活性。2.解离素对大鼠实验性EMT模型形成的不同阶段的治疗作用1)手术法制备大鼠实验性子宫内膜异位症模型:将大鼠的子宫内膜剥离下来,自体移植入腹壁富含血管处。移植后28天,打开腹腔观察异位灶的生长情况。大鼠的给药分为建模前给药、建模后给药、成模后给药三种给药方案。2)解离素EMT建模前给药对大鼠异位灶形成的影响:移植前将子宫内膜浸泡于1.5μg/ml解离素中孵育30min后再施异位移植术,对照组用相同体积生理盐水(normal saline,NS)孵育。移植后28天,打开大鼠腹腔观察异位灶生长情况。3)解离素EMT建模后给药对大鼠异位灶形成的影响:建模手术结束后舌下静脉注射解离素1.5mg/kg,分别于手术一周后、三周后再给予一次尾静脉注射相同剂量的解离素,对照组注射相同剂量NS。移植后28天,打开大鼠腹腔观察异位灶生长情况。4)解离素EMT成模后给药对大鼠异位灶的影响:建模手术28天后打开大鼠腹腔观察异位灶,并判断是否建模成功。建模成功的大鼠随机分成NS对照组、解离素低剂量组(0.75mg/kg)和高剂量组(1.5mg/kg),分组后再分别于第0周、第2周、第3周尾静脉给药一次,三周后打开大鼠腹腔观察异位灶生长情况。3.解离素对大鼠体内外EMT的MMP-9表达影响1)RT-PCR检测解离素对体外培养大鼠子宫内膜异位细胞MMP-9m RNA的表达水平的影响:以1.5μg/ml解离素作用于大鼠子宫内膜异位细胞24 h后,提取RNA进行RT-PCR检测MMP-9m RNA的表达水平,对照组用同体积NS孵育。2)Western blot检测解离素对EMT大鼠体内异位灶MMP-9的表达影响:提取解离素三种给药方案的大鼠子宫内膜异位灶的总蛋白,Western blot检测各组蛋白MMP-9的表达量。结果:1.GBV的分离纯化及活性鉴定GBV经凝胶过滤和阴离子交换层析等分离纯化过程,经SDS-PAGE鉴定为单一蛋白条带,相对分子量约为7700道尔顿(D)。该目的蛋白具有抗ADP诱导的血小板聚集活性,IC50为0.594μg/ml,暂定名为GBV-IV-4,与前人分离结果一致。2.解离素对大鼠实验性EMT模型形成的不同阶段的治疗作用1)手术法制备大鼠实验性子宫内膜异位症模型:手术建模后28天观察发现移植成功的移植物形成透亮的包块,或半透明的囊肿,表面血管清晰,部分异位灶囊肿和周围组结缔组织、脂肪组织粘连,一些囊肿甚至和肠管粘连。形成的子宫内膜异位灶体积为(37.10±14.77)cm3。2)解离素EMT建模前给药对大鼠异位灶形成的影响:NS对照组(n=6)和解离素给药组(1.5μg/ml,n=11)的异位灶体积分别为33.41±28.85 cm3和8.93±11.34 cm3,重量分别为29.01±12.99 mg和11.62±11.42 mg,解离素给药组较NS组异位灶体积明显减小,重量明显减轻(*P0.05)。3)解离素EMT建模后给药对大鼠异位灶形成的影响:NS对照组(n=6)和解离素给药组(1.5mg/kg,n=7)的异位灶体积分别为58.50±37.71 cm3、5.33±5.48 cm3,重量分别为101.98±75.19 mg、19.34±9.71 mg,解离素给药组较NS对照组异位灶体积明显减小(**P0.01),重量明显减轻(*P0.05)。4)解离素EMT成模后给药对大鼠异位灶的影响(n=6):NS对照组、解离素低剂量组(0.75mg/kg·d-1)和高剂量组(1.5mg/kg·d-1)的给药前异位灶体积分别为36.19±19.09 cm3、35.15±15.88 cm3和39.95±9.33 cm3,给药后体积分别为(31.20±15.57 cm3、24.44±14.29cm3、22.01±10.47 cm3。给药前各组异位灶体积差异没有统计学意义;与对照组相比,解离素给药组异位灶体积均减小,差异有统计学差异(*P0.05)。3.解离素对大鼠体内外EMT的MMP-9表达影响1)解离素对体外培养大鼠子宫内膜细胞MMP-9 m RNA表达水平的影响:RT-PCR检测体外培养大鼠子宫内膜异位细胞MMP-9m RNA的表达水平,发现解离素在1.5μg/ml剂量即可明显抑制大鼠子宫内膜异位细胞的MMP-9m RNA表达。实验结果显示:与对照组相比,解离素组中MMP-9m RNA表达有明显下降变化(*P0.05)。2)解离素对大鼠体内子宫内膜异位灶MMP-9的表达影响:Western blot检测大鼠体内子宫内膜异位灶MMP-9的表达,结果显示SD大鼠子宫内膜异位灶在解离素在EMT建模前、建模后以及成模后给药后,MMP-9的表达量较对照组均有所下降(*P0.05)。结论:GBV解离素能使SD大鼠子宫内膜异位灶的体积减小,重量减轻,其对大鼠实验性EMT具有治疗作用;初步的研究表明解离素对SD大鼠EMT的治疗作用可能与其阻断整合素与其配体如细胞外基质(extracellular matrixes,ECM)的结合,减少MMP-9的表达有关。
【关键词】：大鼠 子宫内膜异位症 解离素 MMP-9 粘附 侵袭 血管生成
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.71
【目录】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 第一章 短尾蝮蛇毒解离素的分离纯化及活性鉴定16-26
• 1. 仪器与材料16-17
• 2. 实验方法17-19
• 3. 结果19-24
• 4. 讨论24-26
• 第二章 大鼠实验性子宫内膜异位症模型建立及解离素不同给药方案对异位灶的影响26-40
• 1. 实验材料26
• 2. 实验方法26-29
• 3. 结果29-37
• 4. 讨论37-39
• 5. 附图39-40
• 第三章 解离素对大鼠子宫内膜异位细胞及病灶MMP9表达的影响40-49
• 1. 仪器与材料40-41
• 2. 实验方法41-45
• 3. 结果45-48
• 4. 讨论48-49
• 全文结论49-50
• 参考文献50-53
• 综述53-61
• 参考文献57-61
• 攻读学位期间主要的研究成果61-62
• 致谢62

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本文编号：267822