逆转卵巢癌铂类化疗耐药相关分子研究

发布时间：2020-05-30 11:07

【摘要】：目的:建立沉默ITIH3基因的卵巢癌细胞株Skov3-ITIH3,探索沉默该基因对其化疗敏感性的影响及作用信号通路。方法:(1)慢病毒介导RNAi沉默卵巢癌细胞系SKOV3的ITIH3基因表达,CCK8法检测沉默ITIH3后SKOV3耐顺铂(DDP)IC50值;实时无标记细胞分析技术(RTCA)监测DDP对细胞的抑制随时间变化的情况;平板克隆法检测DDP作用细胞后,细胞克隆形成能力的变化;Western Blot检测DDP作用时间与凋亡信号通路相关蛋白变化的关系;裸鼠皮下荷瘤模型动态分析多次腹腔注射DDP对移植瘤凋亡相关蛋白表达的影响。结果:(1)顺铂对Skov3-ITIH3 RNAi作用的IC50值较两个对照组(Skov3、Skov3-NC)升高(p0.05),耐药指数达2.08倍,接近体外顺铂耐药株(Skov3/DDPII)水平;各剂量顺铂作用下Skov3-ITIH3 RNAi细胞的CI(Cell Index)值较Skov3-NC下降缓慢,各时间点CI值均增高(p0.05);顺铂作用后,Skov3-ITIH3 RNAi细胞克隆形成数较对照组明显增多(p0.05);顺铂刺激下,Skov3-ITIH3 RNAi细胞抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1活化(p0.05),促凋亡蛋白Bak、Bim、Bax等无明显变化趋势,下游凋亡执行蛋白Caspase9、Caspase3被抑制(p0.05),剪切的PARP蛋白减少(p0.05);裸鼠皮下荷瘤模型,随注射DDP次数增多,Skov3-ITIH3RNAi组p-Bcl-2(Ser70、Thr56)蛋白逐渐降低,下游凋亡执行蛋白Caspase9、Caspase7、Caspase3逐渐降低,剪切的PARP蛋白减少(p0.05)。结论:(1)沉默ITIH3基因能诱导卵巢癌Skov3细胞对顺铂的耐药性增强,凋亡率下降,克隆形成能力增加。其耐药性增加可能与Bcl-2凋亡信号通路中相关蛋白改变有关。ITIH3可能是Bcl-2凋亡信号通路的上游调控蛋白。目的:研究A2M基因逆转卵巢癌细胞铂类耐药的机制。方法:Western Blot检测裸鼠移植瘤TGFβ、PARP等蛋白的相对表达量,CCK8法检测A2M作用下细胞对顺铂的IC50值,流式细胞技术检测A2M作用下细胞凋亡率的改变,ELISA检测A2M作用下细胞液中TGFβ的变化,QRT-PCR检测凋亡节点基因m RNA的相对表达量。结果:Western Blot检测到随顺铂注射次数增加,TGFβ、PARP、c-PARP在耐药瘤组织的相对表达量下调。体外细胞实验表明在A2M蛋白影响下,体外耐药细胞株Skov3/DDPII对顺铂的IC50值下降,凋亡率升高。随A2M浓度增加,细胞培养液中TGFβ升高。细胞m RNA QRT-PCR结果表明随A2M浓度增加,TGFβ-smad通路活化越明显,且呈梯度变化。结论:A2M能逆转卵巢癌顺铂体外耐药株Skov3/DDPII细胞的耐药性。A2M基因是铂类耐药上游调控关键基因,其通过改变TGFβ-smad凋亡信号通路中相关蛋白的表达调控了肿瘤细胞耐药性。目的:体外分离培养原代卵巢癌腹膜转移灶细胞(OM),实验检测卵巢癌患者对多种常用化疗药物的敏感性和二甲双胍的增敏效果,初步探讨对卵巢癌个体化化疗的应用价值。方法:从一例初次手术卵巢癌患者的手术切除标本中分离卵巢癌腹膜转移灶进行细胞培养。RTCA对低代数(P2-P4)细胞进行常规化疗药物、组合药物及配伍药物敏感实验,检测二甲双胍的增敏效果。结果:OM体外可以持续增殖。铂类药物中,对细胞杀伤作用最强的单药是奈达铂,其次为卡铂和顺铂。化疗组合中奈达铂和多西紫杉醇联合使用对肿瘤细胞的杀伤作用最佳。二甲双胍能增加肿瘤细胞对以铂类为基础的化疗药物的敏感性。结论:通过RTCA系统对低代数原代卵巢癌腹膜转移肿瘤细胞的药物敏感性进行快速分析,为个体化优选更高效的临床化疗方案提供支持。RTCA检测分析结果可以作为判断患者是否适用二甲双胍作为增敏剂的依据。
【图文】：

图 1-1 嘌呤霉素筛选后 100 倍镜下 Skov3-ITIH3 RNAi 和 Skov3-NC 荧光状态。Fig 1-1 Skov3-ITIH3 RNAi and Skov3-NC after Puromycin selection.3.2.2 Western Blot 验证沉默效果BCA 法绘制蛋白标准曲线（图 1-2），拟合方程 y=20.212x-4.2989，计算出各细胞系蛋白样品的总蛋白含量。Western Blot 检测各细胞中 IT蛋白的表达量。结果表明 Skov3-ITIH3 RNAi 细胞 ITIH3 蛋白的表达量约Skov3 和 Skov3-NC 细胞的 30%（图 1-3），接近体外耐药细胞株 Skov3/DD中的表达量，证实细胞株 Skov3-ITIH3 RNAi 确沉默 ITIH3 且可用于后续验。

图 1-2 BCA 法测量蛋白浓度的拟合标准曲线Fig 1-2 Fitting curve of protein absorbance value measured by BCA kit.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31

【参考文献】

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本文编号：2688042