孕期双酚A暴露对子代雌鼠青春期发育提前与下丘脑PcG蛋白关键基因甲基化和相关激素水平的影响及其关键期研究

发布时间：2020-06-15 05:51

【摘要】：研究一:孕期双酚A暴露对子代雌鼠青春期发育提前与下丘脑Pc G蛋白关键基因甲基化和相关激素水平的影响目的探讨孕期母体双酚A(BPA)暴露对子代雌鼠青春期提前、下丘脑调控青春期启动的Pc G蛋白关键基因Eed、Ezh甲基化水平以及青春期发育相关激素水平的影响;同时探讨下丘脑Pc G蛋白关键基因甲基化在联结孕期母体BPA暴露与子代青春期发育提前中的作用。方法将40只受孕CD-1小鼠随机均分为对照组(玉米油)、低剂量组(8 mg/kg)、中剂量组(40 mg/kg)和高剂量组(200 mg/kg)。于妊娠1~18天(GD 1~18),每日对暴露组进行BPA灌胃染毒,对照组则进行玉米油灌胃。子代仔鼠出生后通过肛门与生殖器之间的距离判断性别。出生后21天(PND 21)天将子代小鼠断乳,并且分开饲养。PND 21~33,每日观察子代雌鼠阴道开口情况,对已经阴道开口的雌鼠进行阴道涂片,观察涂片细胞变化以判断其动情阶段。PND 1、2、3、7、14、21、28、33天称量雌鼠重量。于PND 34,全部子代雌鼠经眼球穿刺取血处死,收集下丘脑组织。使用放射免疫法(RIA)检测子代雌鼠血清中Kisspeptin-10、促性腺激素释放激素(Gn RH)激素水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测子代雌鼠血清促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、雌二醇(E2)水平。RT-PCR检测下丘脑Eed、Ezh m RNA水平,焦磷酸测序检测Eed、Ezh甲基化水平。结果与对照组相比,BPA暴露组子代小鼠总数、雌鼠数、雄鼠数未发生明显变化,差异无统计学意义(P值均0.05)。中、高剂量孕期母体BPA暴露组子代雌鼠比例均低于低剂量组,差异有统计学意义(P值均0.05),而与对照组相比,各剂量BPA暴露组子代雌鼠比例差异均无统计学变化(P值均0.05)。与对照组相比,8 mg/kg、40 mg/kg和200 mg/kg孕期母体BPA暴露组的子代雌鼠体重增长差异均无统计学意义(P值均0.05)。各剂量BPA暴露组的子代雌鼠阴道开口时间和第一次动情时间均早于对照组,差异均有统计学意义(P值均0.05)。各剂量BPA暴露组PND 28阴道开口率均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。而动情期时间在各组之间差异无统计学意义(P0.05)。与对照组相比,8 mg/kg BPA暴露组动情周期时间增加,差异有统计学意义(P0.05)。孕期母体各剂量BPA暴露组子代雌鼠Eed1和Eed2甲基化水平均高于对照组,差异有统计学意义(P值均0.05)。与对照组相比,各剂量BPA暴露组Ezh1甲基化水平差异均无统计学意义(P0.05)。与对照组相比,孕期母体BPA暴露组Ezh2甲基化水平均明显增加,差异有统计学意义(P值均0.05)。孕期各剂量BPA暴露组子代雌鼠Eed1和Eed2的m RNA表达水平均低于对照组,差异具有统计学意义(P值均0.05)。对于Ezh1 m RNA表达水平,BPA暴露组与对照组之间差异均无统计学意义(P0.05)。与对照组相比,8 mg/kg和40 mg/kg BPA暴露组Ezh2m RNA表达水平降低,而200 mg/kg BPA暴露组Ezh2 m RNA有所增加,差异有统计学意义(P值均0.05)。各剂量BPA暴露组的子代雌鼠血清Kisspeptin-10与Gn RH水平均高于对照组,差异有统计学意义(P值均0.05)。8 mg/kg BPA暴露组血清LH水平与对照组相比有所降低,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,孕期母体各剂量BPA暴露组子代雌鼠血清FSH、E2水平差异均无统计学意义(P值均0.05)。对照组、8 mg/kg和40 mg/kg BPA暴露组中,青春期提前的子代雌鼠Eed1、Eed2、Ezh2基因甲基化、Kisspeptin-10水平均要高于青春期未提前的子代雌鼠;而在200 mg/kg BPA暴露组中,青春期提前的子代雌鼠Eed1、Ezh2甲基化、Kisspeptin-10、Gn RH水平要高于青春期未提前的子代雌鼠,差异均有统计学意义(P值均0.05)。BPA暴露组Eed1、Eed2、Ezh2基因甲基化、激素水平与青春期提前之间的相关系数要高于对照组。BPA对青春期提前未产生直接影响,路径系数未达到显著性水平(P0.05);BPA通过Eed2、Ezh2基因甲基化对青春期提前产生间接影响,路径系数达到显著性水平(P0.05)。结论本研究结果表明孕期母体BPA暴露会导致子代雌鼠青春期发育提前,并且增加子代雌鼠下丘脑Eed、Ezh基因的甲基化程度。而且证明Eed、Ezh基因甲基化在孕期母体BPA暴露与子代雌鼠青春期提前的中介效应。这表明孕期母体BPA暴露引起青春期发育提前的机制与这两个基因的甲基化程度增高有关。研究二:孕期双酚A暴露对子代雌鼠青春期发育提前影响的关键期研究目的研究不同孕期母体BPA暴露对子代雌鼠青春期发育提前以及下丘脑Pc G蛋白关键基因甲基化的影响,探讨孕期母体BPA暴露影响子代雌鼠青春期发育提前的“关键期”。方法48只受孕CD-1小鼠随机均分为孕早期组、孕中期组、孕晚期组,每组再进一步随机分成对照组(玉米油)和BPA染毒组(8 mg/kg)。于GD 1~6天,对孕早期染毒组进行BPA灌胃暴露,对照组进行玉米油灌胃;于GD 7~12,对孕中期染毒组进行BPA灌胃暴露,对照组进行玉米油灌胃;于GD 13~18,对孕晚期染毒组进行BPA灌胃暴露,对照组进行玉米油灌胃。子代仔鼠出生后通过肛门与生殖器之间的距离判断性别。PND 21将子代小鼠断乳,并且按照比例分开饲养。PND 21~33,每日观察子代雌鼠阴道开口情况,对已经阴道开口的雌鼠进行阴道涂片,观察涂片细胞变化以判断其动情阶段。于PND 1、7、14、21、28、33天称量雌鼠重量。于PND 34,全部子代雌鼠经眼球穿刺取血处死,收集下丘脑组织。使用RIA检测子代雌鼠血清检测血清中Kisspeptin-10、Gn RH激素水平。RT-PCR检测下丘脑Eed、Ezh m RNA水平。焦磷酸测序检测Eed、Ezh甲基化水平。结果与对照组相比,不同孕期8 mg/kg BPA暴露的子鼠数量、雌鼠数量、雄鼠数量、雌鼠比例均无统计学差异(P值均0.05)。与对照组相比,各孕期母体BPA暴露组子代雌鼠体重增长差异均无统计学意义(P值均0.05)。不同孕期给予母体8 mg/kg BPA灌胃处理后,与对照组相比,孕中期母体8mg/kg BPA染毒组的子代雌鼠阴道开口时间较早,差异有统计学意义(P0.05),而孕早期、孕晚期8 mg/kg BPA染毒组阴道开口均无统计学差异(P值均0.05)。孕中期母体BPA暴露的子代雌鼠阴道开口提前率高于孕中期对照组,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,不同孕期母体BPA暴露的子代雌鼠动情期时间、动情周期时间差异均无统计学意义(P值均0.05)。不同孕期母体BPA暴露后,子代雌鼠Eed1甲基化程度均高于对照组,差异有统计学意义(P值均0.05);而对于Eed2甲基化检测结果显示,与对照组相比,孕中期BPA染毒组甲基化水平明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。不同孕期母体BPA暴露子代雌鼠Ezh1甲基化水平与对照组相比差异均无统计学意义(P值均0.05);与对照组相比,孕中、晚期母体8 mg/kg BPA暴露会增加子代雌鼠下丘脑Ezh2甲基化水平,差异有统计学意义(P值均0.05)。孕中、晚期母体给予8 mg/kg BPA灌胃暴露会导致子代雌鼠下丘脑Eed1 m RNA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P值均0.05);不同孕期母体BPA暴露组子代雌鼠Eed2 m RNA表达水平均低于对照组,差异有统计学意义(P值均0.05);而对于Ezh基因表达检测,结果显示孕中期母体BPA染毒组的子代雌鼠Ezh1 m RNA表达水平要低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);而孕早、中期母体BPA暴露的子代雌鼠Ezh2 m RNA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P值均0.05)。孕早期暴露组的子代雌鼠血清Kisspeptin-10含量低于对照组,而孕中期、孕晚期暴露组子代雌鼠血清Kisspepitn-10水平要高于对照组;孕中期、孕晚期BPA暴露组Gn RH水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P值均0.05)。结论本研究通过对不同孕期母体BPA暴露对子代雌鼠青春期提前、血清激素水平和青春期启动基因影响的研究,发现孕中期母体BPA暴露显著提前子代雌鼠青春期启动时间,并且发现在孕中、晚期暴露于BPA的子代雌鼠青春期启动基因甲基化程度明显增加。这表明孕期母体BPA暴露对子代雌性青春期提前影响的“关键期”可能在孕中、晚期。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R715.3

【参考文献】