MiR-629通过靶向TSPYL5实现对卵巢癌的调控机制研究

发布时间：2020-06-20 22:37

【摘要】：卵巢癌的分子机制很繁锁,研究表明mi RNA是关键调节因子。本研究旨在探讨卵巢恶性肿瘤发展中mi R-629的主要作用,揭示其可能的分子机制。睾丸特异性Y样蛋白5(TSPYL5)是各种癌症中的肿瘤抑制基因,但其在卵巢癌中的作用研究很少。本研究分三部分。第一部分卵巢癌中mi R-629和TSPYL5的作用研究目的:探讨卵巢癌组织中mi R-629及TSPYL5的差异表达及mi R-629对卵巢癌细胞的影响。方法:1.利用RT-PCR检测肿瘤及邻近组织中mi RNA的水平,再用RT-PCR、Western-blot检测TSPYL5的表达,选mi R-629及TSPYL5为目的基因,同时免疫组化、HE染色研究卵巢癌组织的病理特征。2.合成mi R-629-inhibitor和mi R-629-mimics,分别转染OVCAR3细胞抑制或增强mi R-629的功能作为实验组,mock组作为对照。流式细胞术、Transwell、细胞划痕实验等进行细胞功能实验。结果:1.病理结果表明卵巢癌组织中有大量的大细胞核,caspase3表达明显受抑制。相对于癌旁组织mi R-629在卵巢癌中高表达,而TSPYL5表达减少或缺失(P0.05)。2.流式实验结果显示,过表达mi R-629显著降低OVCAR3细胞凋亡率,并且在mimics组和mock组中有显著差异。细胞周期测定进一步证实mi R-629对细胞凋亡和增殖的抑制作用。细胞划痕实验结果表明,与mock组细胞相比,过表达mi R-629有效地促进了细胞迁移,其中mi R-629-inhibitor组具有最广泛的细胞划痕。Transwell结果表明mi R-629的过表达明显促进OVCAR3细胞的侵袭,mimics组和mock组有显著差异(P0.05)。结论:mi R-629促进OC细胞增殖、迁移和侵袭。TSPYL5在OC组织和细胞系中均起抑制肿瘤的作用。第二部分Mi R-629通过靶向调控TSPYL5抑制卵巢癌恶性行为体外机制研究目的:探讨mi R-629在卵巢癌进展中的关键作用,揭示其作用可能的分子机制。方法:1.合成pc DNA3.1-TSPYL5转染OVCAR3细胞,同时合成TSPYL5-空载质粒转染OVCAR3作为对照组,利用Transwell、流式细胞术、细胞划痕实验检测细胞功能。2.mi RWALK预测TSPYL5为mi R-629的潜在靶标。截取TSPYL5 3'UTR序列,构建psi-CHECK2野生型和突变型载体,同时转染mi R-629,双荧光素酶实验验证mi R-629与TSPYL5的关系。3.OVCAR3细胞分别被转染mi R-629-inhibitor、和mi R-629-inhibitor-si TSPYL5a作为实验组,black组和NC组作为对照组。Transwell、划痕、流式分别检测各组细胞的侵袭、迁移、增殖、凋亡等功能。结果:1.细胞功能结果显示,TSPYL5过表达可以促进OVCAR3细胞凋亡(P=0.022);TSPYL5能抑制细胞增殖,缩短细胞周期的S期,提高G0/G1比值(P=0.022);TSPYL5也抑制了细胞的迁移和侵袭,与NC相比,细胞凋亡率显著增加(P0.01),迁移和侵袭能力降低(P0.01)。2.来自mi RWALK潜在靶点中TSPYL5和mi R-629结合可能性比较大,双荧光素酶实验报告证明,mi R-629抑制野生型TSPYL5 3'UTR的荧光素酶活性,但在突变型TSPYL5 3'UTR中阻止这种抑制。3.细胞功能结果显示,用mi R-629抑制剂转染细胞后,细胞凋亡减少,G0/G1期增强,细胞迁移率增加,而和TSPYL5-si RNA共转染组显著阻断细胞凋亡、迁移和侵袭。而空白组中OVCAR3细胞具有最活跃的迁移和侵袭能力。结论:TSPYL5在卵巢癌中起肿瘤抑制作用。mi R-629通过直接结合TSPYL5的3'UTR来抑制OC细胞中TSPYL5的表达,促进了卵巢癌的发展。相反,干预mi R-629的表达,可抑制卵巢癌的恶性行为。第三部分mi R-629抑制裸鼠卵巢移植瘤生长机制研究目的:mi R-629对卵巢肿瘤生长体内影响的机制研究。方法:首先采用mi R-629 inhibitor慢病毒感染OVCAR3,获取稳定干扰的肿瘤细胞,再注射到裸鼠皮下成瘤,并定期测量瘤体体积;30天后处死裸鼠,剥离瘤体,用RT-PCR和Western-blot分别检测瘤体中mi R-629和TSPYL5的表达水平;同时,采用HE染色检测瘤体病理情况,免疫组化检测TSPYL5的表达情况。结果:瘤体的体积在移植瘤后15天时出现差异,随着继续饲养,差异进一步拉大;在第30天时,inhibitor组瘤体显著小于空白组和对照组。RT-PCR结果表明,mi R-629在inhibitor组瘤体中的表达显著低于空白组和对照组,而TSPYL5的表达则相反,进一步Western-blot结果显示,TSPYL5在inhibitor中表达较高。同时,免疫组化结果,与空白组和对照组相比,TSPYL5在inhibitor组中表达更高;且瘤体出现组织坏死的情况。结论:研究进一步在体内验证了干预mi R-629的表达,能够上调TSPYL5的表达水平,同时对卵巢肿瘤的生长产生抑制作用。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：

扩增曲线,特异性,条带,管家基因

所有 RT-PCR 使用 ABI Prism 7500 系统进行。为每个样品设计复孔，平均值作为测试结果。最小化逆转录中 RT-PCR 反应和样品之间的管家基因 U6 用作内参及 GAPDH 来样品标准化。样品相对于参照样品的倍 2-ΔΔCt。结果表明，管家基因和样品靶基因均通过 RT-PCR 扩增并通过琼脂泳检测，单条带，RT-PCR 反应特异性好（图 1），具有良好的扩增曲线线（图 2），说明我们所设计的引物具有特异性并且反应体系稳定。RT-P现，与卵巢癌癌旁组织相比，卵巢癌组织中 miR-449b-3p，miR-483-5P，miR922 低表达，而 miR-23-5p， miR-150-3p， miR-505，miR-30-3P，miR-6510-3P 高表达，其中 miR-629 在癌组织和癌旁组织中比较，其差异最大，取 miR-629 作为目的 miRNA（图 3）。目标 miRNA、 GAPDH、TSPYL5设计（表 1）。

靶向,调控机制,卵巢癌

溶解扩增图

【参考文献】