miR-548c下调Twist对子宫内膜癌和卵巢癌迁移和侵袭的影响及机制研究

发布时间：2020-06-21 09:02

【摘要】：【背景】子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)为女性重要恶性肿瘤之一,约占女性生殖系统肿瘤的20-30%。子宫内膜癌多发生于绝经后的女性,但近几年来的临床统计资料表明,该病的发病率呈逐年升高趋势。尽管早期子宫内膜癌经过规范治疗之后,患者的5年生存率有了很大提高,但对于晚期、低分化子宫内膜癌或者特殊类型的子宫内膜癌患者来说,其预后往往较差,因此是造成患者死亡的重要因素之一。子宫内膜癌发病的临床表现之一为不规则阴道流血,因此往往被误认为是围绝经期的月经紊乱,当患者去医院就诊时则为时已晚,因此耽误了最佳的治疗时机。子宫内膜癌的发生具有较为严格的演变过程,若在癌前病变前采取有效的干预措施,则可能降低该病的发病率。所以寻找能够有效诊断和治疗的分子标志物对于子宫内膜癌的治疗具有十分重要的意义。卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是指生长在卵巢上的恶性肿瘤。由于卵巢位于盆腔深部,卵巢癌早期无典型症状,筛查的作用又极其有限,而且不具有特异性,因此卵巢癌的早期诊断比较困难。约有60%~70%的患者就诊时已为晚期病例,即使目前肿瘤治疗已经取得了突破性进展且新的治疗手段也不断出现,但对于卵巢癌晚期病例治疗的效果依然不理想,因此卵巢癌的死亡率居于妇科恶性肿瘤死亡率的首位。目前依然缺乏有效鉴别卵巢癌组织类型及良恶性的有效方法,无论在诊断和治疗上对卵巢癌患者来说都是一大难题。miRNA属于内源性单链非编码单链小分子RNA,研究显示多种miRNA与包括子宫内膜癌和卵巢癌在内的恶性肿瘤的发生以及发展过程有关。miR-548属于miRNA家族中的成员之一,目前已有研究显示,miR-548c在乳腺癌、肝癌、骨肉瘤中呈低表达状态,因此具有类似抑癌基因的作用。但目前尚未有对于miR-548c在卵巢癌和子宫内膜癌中的作用以及相关机制的研究。转移是造成子宫内膜癌和卵巢癌患者死亡的主要原因。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)被认为是子宫内膜癌和卵巢癌转移的关键步骤,这增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,进而促进其恶性化进展。因此,了解介导子宫内膜癌和卵巢癌细胞的迁移、侵袭和EMT过程的分子机制可以确定未来治疗这些癌症的新分子靶点。Twist蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋结构(basic helix-loop-helix,b HLH)转录因子家族成员,为调控EMT的关键基因,能够促进胚胎发育,通过促使中胚层上皮细胞向间质细胞转化,从而使中胚层细胞具有迁移能力,最终对生物机体各个器官的生长发育产生促进作用。目前已有研究证实,Twist在子宫内膜癌和卵巢癌组织中均呈异常高表达状态,从而提示Twist在上述两种恶性肿瘤中均具有促癌基因的作用。【目的】本研究检测miR-548c和Twist在子宫内膜癌和卵巢癌中的表达水平,并分析两者与上述两种肿瘤临床病理参数的关系。通过体外细胞实验研究miR-548c对子宫内膜癌和卵巢癌细胞生物学行为的影响,并对其是否通过靶向调控Twist基因的表达影响子宫内膜癌和卵巢癌细胞侵袭和迁移进行探讨。旨在明确miR-548c在子宫内膜癌和卵巢癌细胞恶性化进程中的具体作用机理,为寻找新的有效诊断、治疗子宫内膜癌和卵巢癌的分子靶标奠定理论和实验基础。【方法】1.本研究采集50对原发性子宫内膜癌组织和癌旁相应正常组织,同时采集60例上皮型卵巢癌组织和20例正常上皮型卵巢组织,采用荧光定量PCR检测上述组织样本中miR-548c和Twist m RNA的表达,分析miR-548c与卵巢癌患者临床病理参数的相关性,同时分析miR-548c与子宫内膜癌和卵巢癌患者预后的关系。2.将人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1A)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)均随机分为2组,即Anti-Ctr组:将miRNA inhibitor control转染细胞;Anti-548c组:将miR-548c inhibitor转染细胞。检测各组细胞的增殖活性、凋亡率、迁移能力和侵袭能力。3.采用生物学软件预测miR-548c的靶基因,并通过荧光素酶报告系统进行验证,检测miR-548c表达上调和下调后对RL95-2、HEC-1A和SKOV-3细胞中Twist蛋白表达的影响。检测miR-548c表达上调和下调后对RL95-2、HEC-1A和SKOV-3细胞中EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA表达的影响。分别将miR-548c inhibitor/miR-548c mimic和/或Twist si RNA/Twist c DNA转染RL95-2、HEC-1A和SKOV-3细胞,检测上述细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力,检测细胞中Twist蛋白的表达。【结果】1.miR-548c在子宫内膜癌和卵巢癌组织中的表达水平显著降低,Twist在子宫内膜癌和卵巢癌组织中的表达水平显著增高相较于癌旁相应正常组织,miR-548c在子宫内膜癌组织中的表达水平显著降低(P0.01)。相较于正常卵巢组织,miR-548c在卵巢癌组织中的表达水平显著降低(P0.01)。在浆液性癌、III-IV期和3级肿瘤组织中miR-548c的表达显著低于非浆液性、I-II期和1-2级肿瘤组织。与miR-548c高表达的子宫内膜癌患者相比,miR-548c低表达的子宫内膜癌患者的总体生存率较差。尽管在本研究使用TCGA数据进行Meta分析未能显示出miR-548c表达水平与卵巢癌发生风险的关系(P=0.425),但miR-548c表达下调的卵巢癌患者的生存期较短。相较于癌旁相应正常组织,Twist m RNA在子宫内膜癌组织中的表达水平显著增高(P0.01)。相较于正常卵巢组织,Twist m RNA在卵巢癌组织中的表达水平显著增高(P0.01)。在浆液性癌、III-IV期和3级肿瘤组织中Twist m RNA的表达显著高于非浆液性、I-II期和1-2级肿瘤组织。2.miR-548c能够抑制细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均明显增高(P0.01),凋亡率明显下降(P0.01);在OVCAR3细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均显著升高(P0.01),凋亡率明显下降(P0.01);在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均明显降低(P0.01),凋亡率明显上升(P0.01);在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均明显降低(P0.01),凋亡率明显上升(P0.01)。3.Twist被确定为miR-548c的直接靶基因在RL95-2细胞中,当miR-548c表达水平抑制后,转染Twist-WT质粒的细胞中荧光素酶的表达水平明显升高(P0.01),而转染Twist-Mut质粒的细胞中荧光素酶的表达水平则无明显变化(P0.05)。在HEC-1A和SKOV-3细胞中,当miR-548c表达水平上调后,转染Twist-WT质粒的细胞中荧光素酶的表达水平明显降低(P0.01),而转染Twist-Mut质粒的细胞中荧光素酶的表达水平则无明显变化(P0.05)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞中Twist蛋白的表达水平明显增高(P0.01),E-cadherin m RNA的表达水平明显降低(P0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA的表达水平则明显升高(P0.01)。在HEC-1A和SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞中Twist蛋白的表达水平均明显降低(P0.01),E-cadherin m RNA的表达水平明显上升(P0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9m RNA的表达水平则显著降低(P0.01)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的增殖活性明显增高(P0.01);与Anti-548c组相比,Anti-548c+Twist si RNA组细胞的增殖活性显著降低(P0.01)。在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性明显降低(P0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的增殖活性明显升高(P0.01)。在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性明显降低(P0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的增殖活性无明显变化(P0.05)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的侵袭和迁移能力明显增高(P0.01);与Anti-548c组相比,Anti-548c+Twist si RNA组细胞的侵袭和迁移能力显著降低(P0.01)。在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的侵袭和迁移能力明显降低(P0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的侵袭和迁移能力明显升高(P0.01)。在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的侵袭和迁移能力明显降低(P0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的侵袭和迁移能力明显增高(P0.05)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞中Twist蛋白的表达水平明显增高(P0.01);与Anti-548c组相比,Anti-548c+Twist si RNA组Twist蛋白的表达水平显著降低(P0.01)。在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组Twist蛋白的表达水平明显降低(P0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组Twist蛋白的表达水平明显升高(P0.01)。在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组Twist蛋白的表达水平明显降低(P0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组Twist蛋白的表达水平明显增高(P0.05)。【结论】1.miR-548c在子宫内膜癌以及卵巢癌组织中的表达水平异常下调,且miR-548c表达下调与子宫内膜癌患者的不良预后有关。2.Twist在上述肿瘤组织中的表达水平异常上调。miR-548c和Twist均与卵巢癌的组织学类型、病例分级、临床分期有关。3.miR-548c通过下调Twist的表达,进而抑制子宫内膜癌和卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移,诱导细胞凋亡,从而抑制子宫内膜癌和卵巢癌发生和发展。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.3
【图文】：

质量图,质量,纯度,整性

糖凝胶电泳检测总 RNA 质量整性是保障后续试验顺利进行的基础，因此对各的检测非常重要。本研究采取甲醛变性琼脂糖凝胶进行测定。得到的结果如图 1.1 所示，从图中观察泳结果图中，这 3 条电泳条带的大小依次由上至下8S、rRNA 5S 的大小相一致。同时，本研究通过超微总 RNA 纯度进行检测，检测得到的结果显示，所值未超过 2.0，均在 1.8~2.0 范围内，具有较高纯度究中提取的总 RNA 具有较好的完整性，能够在下一试验。

子宫内膜癌,卵巢癌组织,表达水平,子宫内膜样

表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。由标本病理均为：子宫内膜样腺癌，且均为 I 期患者，病理没有探讨 miR-548c 与子宫内膜癌患者的病理因素的关系中 miR-548c 的表达水平，本研究对 60 例卵巢癌组织以 miR-548c 的表达情况进行检测（表 1.1）。荧光定量 PC正常卵巢组织，miR-548c 在卵巢癌组织中的表达水平显学意义（P<0.01）。进一步分析发现，在浆液性癌、III-IiR-548c 的表达显着低于非浆液性、I-II 期和 1-2 级肿瘤组果表明 miR-548c 表达下调可能在子宫内膜癌和卵巢癌的

【参考文献】