塞来昔布抑制线粒体P-gp增强卵巢癌细胞化疗敏感性

发布时间：2020-07-01 20:19

【摘要】：目的探究环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布增强卵巢癌细胞紫杉醇和顺铂化疗敏感性的作用及线粒体P糖蛋白(P-gp)相关的分子机制。方法1.MTT实验检测塞来昔布短期(48 h)单药及与紫杉醇或顺铂联用对卵巢癌细胞株A2780及其紫杉醇耐药株A2780T的生长抑制作用。2.流式细胞术检测塞来昔布单药及与紫杉醇或顺铂联用(48 h)对A2780T细胞凋亡的影响;克隆形成实验检测塞来昔布在长期(10-14 d)低浓度(10μM)和高浓度(100μM)下单药及与紫杉醇或顺铂联用对A2780T细胞克隆形成的影响。3.塞来昔布(浓度梯度)处理耐药卵巢癌细胞A2780T后,电子显微镜观察线粒体形态结构的变化;MitoTracker Deep Red标记线粒体后,激光共聚焦显微镜观察多药耐药蛋白P-gp表达和线粒体分布的变化。4.密度梯度离心法提取耐药卵巢癌细胞A2780T和其亲本株A2780细胞线粒体,免疫印迹法(WB)检测提取线粒体的完整性和纯度,流式细胞术检测在细胞外塞来昔布对线粒体转运罗丹明123(Rho123)功能的影响。5.塞来昔布(浓度梯度,时间梯度)处理耐药卵巢癌细胞A2780T后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测多药耐药基因Mdr-1在转录水平的变化;免疫印迹法(WB)检测P-gp蛋白在全细胞水平表达的变化;塞来昔布(浓度梯度)处理耐药卵巢癌细胞A2780T后,提取线粒体,WB检测P-gp蛋白在线粒体水平表达的变化。6.塞来昔布单药及与紫杉醇或顺铂联用处理A2780T细胞,WB检测凋亡相关因子caspase-3,Bcl-2,Bax,PARP等蛋白水平表达变化。结果1.在药物短期(48 h)作用时,塞来昔布单一用药在高浓度(100μM)下抑制A2780T、A2780细胞的生长(p0.05),而低浓度(10μM)作用不明显;同样,在与紫杉醇或顺铂联用时,只有高浓度(100μM)塞来昔布才会在短期内(48 h)增强两种化疗药对两种卵巢癌细胞株的生长抑制作用(p0.05)。2.塞来昔布单药短期(48 h)作用时,随着药物浓度增加,A2780T细胞凋亡增加。高浓度塞来昔布(100μM)与紫杉醇或顺铂联用时,A2780T细胞凋亡增加(p0.01),但是低浓度(10μM)塞来昔布联合用药A2780T细胞的凋亡无显著增加(p0.05)。然而,无论低浓度(10μM)还是高浓度(100μM)塞来昔布长期(10-14 d)作用均可使A2780T细胞的克隆形成明显减少(p0.01,p0.001)。3.塞来昔布使A2780T细胞线粒体出现肿胀、嵴结构消失等凋亡前状态并促进线粒体向细胞核周围聚集。4.密度梯度离心法所提取线粒体纯度高,完整性好;流式细胞检测A2780T细胞线粒体对Rho123的外排率发现,与未处理组(64.77%)相比,塞来昔布预处理组外排率为31.6%,与P-gp特异性抑制剂环孢素A预处理后(19.71%)作用相似。5.在细胞水平,塞来昔布可显著抑制Mdr-1基因的mRNA和蛋白质的表达,这种抑制作用呈浓度时间非依赖性。在线粒体水平,塞来昔布抑制P-gp蛋白表达。6.塞来昔布使caspase-3激活增加,与紫杉醇联用PARP激活显著增加,且与顺铂联用Bcl-2的表达显著降低。结论塞来昔布增强耐药卵巢癌细胞对紫杉醇和顺铂的化疗敏感性,其作用可能是通过抑制线粒体表面P-gp的表达和功能导致线粒体稳态失衡从而启动线粒体凋亡通路实现。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.31
【图文】：

MTT 法检测其对肿瘤细胞的毒性作用，发现 100 μM 以下浓度塞来昔布对肿瘤细胞毒性作用小（图 1A）。100 μM 塞来昔布作用 A2780、A2780T 细胞 48h 后，细胞生存率分别为为 0.81±0.04；0.78±0.04。对于亲本卵巢癌细胞株 A2780 来说，低浓度紫杉醇 0.05μM 或顺铂 4μM 即可对其产生一定的杀伤作用，而与塞来昔布 100μM 联用仍可进一步对其产生明显的生长抑制作用，显著降低肿瘤细胞的生存率（图 1C）；而对于获得性紫杉醇耐药卵巢癌细胞株 A2780T，较高浓度的紫杉醇（30μM）或顺铂（15μM）对其杀伤作用仍不明显，但是与塞来昔布（100μM）联用后 A2780T 细胞的生长抑制作用显著增强（图 1B）。由于肿瘤耐药是目前临床化疗失败的重要因素，增加化疗药物剂量伴随着药物毒性的显著增加，而安全浓度下的紫杉醇对敏感细胞已经有显著的杀伤作用（数据未显示），故接下来我们的实验主要围绕塞来昔布对耐药卵巢癌细胞 A2780T 的生长抑制作用及其机制进行研究。

再分别加入紫杉醇（30μM）或顺铂（15μM）组 A2780T 细胞的凋亡率显著增加（图2B，D）。因我们使用的塞来昔布抑制细胞生长或凋亡的有效浓度（100 μM）远大于临床上每天口服 400mg 所达到的血药浓度（10 μM）。考虑到塞来昔布在临床上是连续给药，而紫杉醇和顺铂等化疗药是周期间歇给药。根据这一特点，我们采用克隆形成实验分析分别长期（10-14d）给予低浓度（10μM）、高浓度（100μM）塞来昔布观察其对 A2780T 细胞集落形成的影响。给药方式如下：塞来昔布单药组持续给予含相应浓度塞来昔布的培养基；紫杉醇或顺铂单药组分别加入加入紫杉醇（30 μM）或顺铂（15μM）处理 48h 后，更换新鲜培养基持续培养；塞来昔布联合紫杉醇或顺铂组首先给予塞来昔布预处理 3h，再分别加入紫杉醇（30 μM）或顺铂（15μM），48h 后撤化疗药，更换为只含塞来昔布的培养基，10-14d 后观察每组克隆形成情况。如图 2E，G 所示

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本文编号：2737228