子宫内膜癌中MiR-23a的表达及其对SIX1调控的机制研究

发布时间：2020-07-19 09:14

【摘要】：目的:探索miR-23a抑制子宫内膜癌发生发展的作用机制。通过检测miR-23a在子宫内膜样癌组织、癌旁组织以及子宫内膜癌细胞系中的表达情况,寻找miR-23a下游靶点及其对SIX1影响的研究,初步探讨miR-23a通过靶向调控SIX1抑制子宫内膜癌的发展,为子宫内膜癌的临床诊断及治疗提供理论基础和依据。方法:第一部分:研究miR-23a在子宫内膜样癌组织、癌旁组织以及子宫内膜癌细胞系中的表达水平:1)应用qRT-PCR方法检测16例患者子宫内膜样癌组织、癌旁组织中miR-23a的表达情况,所有组织标本均来自于天津医科大学第二医院妇科,行手术切除的病人,收集新鲜未经任何干预治疗的子宫内膜样癌组织及相应癌旁组织标本。2)培养Ishikawa细胞、HEC1B细胞细胞系,qRT-PCR检测miR-23a在各细胞系中的表达水平,将miR-23a模拟物或miR-23a ASO转染到Ishikawa细胞或HEC1B细胞中,检测miR-23a表达水平。3)为了测试miR-23a在子宫内膜癌细胞系中的作用,将miR-23a模拟物或miRNA con转染到Ishikawa细胞或HEC1B细胞中,通过细胞功能试验,如克隆形成实验、划痕实验、transwell实验,检测miR-23a对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。第二部分:miR-23a下游靶点SIX1及其对子宫内膜癌细胞生物学行为影响的研究。1)使用microRNA.org、TargetScan、miRanda等软件寻找miR-23a的靶点,在其靶点的列表上发现了SIX1。为了测试miR-23a和SIX1之间是否存在直接作用,采用双荧光报告系统检测的方法,在萤火虫荧光素酶基因下游插入野生型或突变型SIX1 3'UTR。将pGL3-SIX1 UTR WT,pGL3-SIX1 UTR Mut和pGL3构建体分别转染到HEC1B细胞中,给予miR-23a模拟物或miRNA con,检测荧光素酶活性。2)为了验证miR-23a和SIX1在子宫内膜样癌组织中的关系,选取30例子宫内膜样癌组织标本,IHC的方法检测SIX1的表达,并且将30个病例分成2组:SIX1低和高表达组。qRT-PCR的方法检测上述两组中的miR-23a表达(SIX1低和高表达组:每组n=15)。分析miR-23a和SIX1在子宫内膜样癌组织中的表达是否存在相关性。3)为了研究SIX1对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响,使用SIX1质粒或siRNA提高或降低HEC1B或Ishikawa细胞中SIX1的表达,通过细胞功能试验,如克隆形成实验、划痕实验、transwell实验,检测SIX1对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。4)不同miR-23a处理子宫内膜癌细胞系后,Western blot检测SIX1蛋白质表达水平。在HEC1B细胞中,用miR-23a ASO或ASO con处理,检测SIX1蛋白表达水平;在Ishikawa细胞中,用miR-23a模拟物或miRNA con处理,检测SIX1蛋白表达水平。第三部分:初步探讨miR-23a通过靶向调控SIX1抑制子宫内膜癌的发展。1)miR-23a敲低或过表达后,通过同时添加SIX1 siRNA或质粒,来检测对细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响。在HEC1B或Ishikawa细胞中,qRT-PCR检测在不同处理组中miR-23a表达水平。Western blot检测不同处理组中SIX1蛋白表达的水平。通过细胞功能试验,如克隆形成实验、划痕实验、transwell实验,检测不同处理组对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。2)为了验证miR-23a模拟物和/或紫杉醇Taxol的抑制作用并确定miR-23a是否在体内调节SIX1表达,将Ishikawa细胞裸鼠成瘤。检测不同处理组肿瘤体积大小。Western blot评估小鼠肿瘤中的SIX1的表达水平。结果:第一部分:1)与癌旁组织相比,miR-23a表达水平在子宫内膜样癌组织中平均减少42%(分别为P0.05)。2)miR-23a模拟物或miR-23a ASO转染到Ishikawa细胞或HEC1B细胞中,miR-23a的表达增加或降低(分别为P0.05)。3)细胞功能实验结果显示,过表达miR-23a可抑制Ishikawa细胞和HEC1B细胞的增殖、迁移及侵袭能力(分别为P0.05):克隆实验结果显示,miR-23a模拟物转染细胞后,细胞增殖能力明显减弱(分别为P0.05);划痕实验结果显示,miR-23a模拟物转染细胞后,划痕空间显著变宽(分别为P0.05);transwell测定的结果显示,miR-23a模拟物转染细胞后,侵袭的细胞显著减少(分别为P0.05)。第二部分:1)miR-23a显著降低野生型SIX1 3'UTR相对的荧光素酶活性(P0.05),但miR-23a不能降低突变型SIX1 3'UTR相对的荧光素酶活性(P0.05)。结果表明miR-23a可能直接与SIX1 3'UTR结合。2)在SIX1低和高表达组织样品之间,miR-23a的表达存在显著差异(P0.05),表明miR-23a和SIX1在子宫内膜样癌组织中的表达存在负相关性。3)SIX1质粒组或siRNA组处理HEC1B细胞或Ishikawa细胞后,SIX1蛋白的表达分别增加或减少(分别为P0.05)。细胞功能实验结果显示,SIX1的表达增加或减少后,HEC1B细胞或Ishikawa细胞的增殖、迁移及侵袭能力增强或减弱。克隆实验结果显示:SIX1的表达增加或减少后,HEC1B细胞或Ishikawa细胞增殖能力分别显著增强或减弱(分别为P0.05)。划痕实验结果表明:在HEC1B细胞或Ishikawa细胞中升高或降低SIX1,导致划痕宽度显著缩小或增大(分别为P0.05)。transwell结果显示:在HEC1B或Ishikawa细胞中,SIX1表达增加或减少后,侵袭的细胞数目显著增多或减少(分别为P0.05)。4)在HEC1B细胞中用miR-23a ASO处理后,SIX1蛋白表达水平显著增高(P0.05)。在Ishikawa细胞中用miR-23a模拟物处理,SIX1蛋白表达水平显著降低(P0.05)。总之,miR-23a可以下调子宫内膜癌细胞中SIX1的表达。第三部分:1)在HEC1B细胞中,miR-23a ASO组中miR-23a表达水平降低(P0.05),而SIX1 siRNA+miR-23a ASO组与miR-23a ASO组相比较,miR-23a的表达水平无统计学差异(P0.05)。在Ishikawa细胞中,miR-23a模拟物组中miR-23a表达水平增加(P0.05),而SIX1质粒+miR-23a模拟物组与miR-23a模拟物组相比较,miR-23a的表达水平没有统计学差异(P0.05)。结果证明,当miR-23a的敲低或过表达后,通过添加SIX1 siRNA或质粒,miR-23a的表达没有减少或增加。但是在miR-23a ASO或miR-23a模拟组中,miR-23a的敲低或过表达后,SIX1表达增加或减少(分别为P0.05),同时在HEC1B细胞或Ishikawa细胞中添加SIX1siRNA或质粒,SIX1表达减少或增加(分别为P0.05)。结果表明miR-23a靶向调控子宫内膜癌细胞中SIX1的表达。细胞功能实验结果显示:克隆实验,划痕实验和transwell测定的结果表明,在HEC1B细胞或Ishikawa细胞中,miR-23a ASO或miR-23a模拟组中miR-23a的敲低或过表达后,细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强或减弱(分别为P0.05),但是当miR-23a敲低或过表达后,可以通过下调或上调SIX1的表达来恢复,从而改变细胞的增殖、迁移和侵袭能力(分别为P0.05)。总之,miR-23a可以通过靶向SIX1来抑制子宫内膜癌的发展。2)与MOCK对照组相比,紫杉醇Taxol组的平均肿瘤体积显著减小(P0.05)。与模拟物阴性对照组相比,miR-23a模拟物和miR-23a模拟物+Taxol组的平均肿瘤体积显著减小(分别为P0.05)。此外,与Taxol组相比,miR-23a+Taxol组的平均肿瘤体积显著减小(P0.05)。Western blot检测小鼠肿瘤中的SIX1表达水平,结果显示:miR-23a模拟物组和/或Taxol组,SIX1的表达水平降低(分别为P0.05)。与Taxol组比较,miR-23a模拟物+Taxol组中SIX1的表达水平显著降低(P0.05)。用miR-23a模拟物和/或Taxol处理的小鼠,其体重没有显著差异,所测试的小鼠中没有因实验方法出现不良反应,并且通过血细胞计数或观察肝脏以及肾功能,没有观察到毒性作用。这些结果证明了miR-23a模拟物和/或Taxol的抗肿瘤作用和安全性。总之,上述结果表明miR-23a可通过靶向调控SIX1抑制体内子宫内膜癌的发展。结论:本研究发现miR-23a可能是子宫内膜癌细胞中的“抑癌基因”,miR-23a-SIX1相互作用的异常改变可能与子宫内膜癌的发展有关。本研究结果表明SIX1被miR-23a靶向调控,当miR-23a敲低或过表达后,通过在体外添加SIX1siRNA或质粒,改变细胞功能,导致细胞增殖,迁移,侵袭功能被下调或上调。miR-23a可通过靶向调控SIX1抑制子宫内膜癌的发展。miR-23a可能作为子宫内膜癌治疗的靶点。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.33
【图文】：

子宫内膜样癌,表达水平,细胞系,模拟物

17图 1. 检测 16 例人组织（子宫内膜样癌和癌旁组织）中 miR-23a 的表达水平。 A.与配对的癌旁组织相比，miR-23a 在子宫内膜样癌组织中的表达水平平均减少 42％。 B.在 HEC1B 细胞系中 miR-23a 模拟物组与 miRNAcon 对照组比较，miR-23a 表达水平增高（P <0.05）。 C.在 Ishikawa 细胞系中 miR-23a ASO转染组与 ASO con 对照组比较，miR-23a 表达水平降低（P <0.05）。

溶解曲线,模拟物,转染细胞,内膜癌

图 1.miR-23a 的 qRT-PCR 扩增曲线（D）及溶解曲线（E）我们可以看出，D 是 miR-23a 的 qRT-PCR 的扩增曲线；E 是 miR-23a 的qRT-PCR 溶解曲线图。1.2.2 miR-23 过表达抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力体外实验检测 miR-23a 对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。细胞功能实验结果显示，miR-23a 表达增加可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力（分别为 P <0.05，图 2A，2B 和 2C）：细胞平板克隆实验结果显示，miR-23a模拟物转染细胞后增殖能力与对照组相比明显减弱（分别为 P <0.05，图 2A）。此外，划痕实验的结果显示，与对照相比，miR-23a 模拟物转染细胞后，划痕空间显著更宽（分别为 P <0.05，图 2B）。而且，transwell 测定的结果显示，与对照相比，miR-23a 模拟物转染细胞后，侵袭细胞显著减少（分别为 P <0.05，图2C）。总之，这些结果表明，子宫内膜癌组织中 miR-23a 表达降低，miR-23 过表达抑制子宫内膜癌细胞的细胞增殖、迁移和侵袭。

宫内膜癌,体外实验,细胞增殖

体外实验miR-23a对子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

【参考文献】