【摘要】：第一部分载UCNPs-RB相变型纳米粒的制备、表征、性能目的制备以全氟己烷(PFH)为内核、叶酸修饰的脂质为壳,包载了上转换发光纳米粒偶联光敏剂孟加拉玫瑰红(UCNPs-RB)、化疗药10-羟基喜树碱(HCPT)的纳米粒FA/UCNPs-RB/HCPT/PFH@Lipid(缩写为FURH-PFH-NPs),使其具有声致相变、多模态成像、肿瘤治疗的性能。方法(1)制备光敏剂孟加拉玫瑰红和稀土上转换发光纳米粒的共价偶联产物,并验证其具备发生荧光共振能量传递的功能(FRET)。(2)采用旋转蒸发的方法制备脂质膜。(3)利用超声法制备这种多功能FURH-PFH-NPs。(4)利用光镜、电镜、Malvern激光粒径分析仪等仪器对其进行基本性能的检测及验证,为后续实验提供相应的支持。结果通过透射电镜观察FURH-PFH-NPs,发现其大小、形态较均匀,呈球形,UCNPs-RB均匀分布并且突出其表面,分散性好。Malvern激光粒径仪所检测的粒径为220.2±76nm,分散指数(PDI)为0.093,Zeta电位为-0.24mV。能谱仪EDS检测其能谱图中包含有Na和La元素的峰。在4℃条件下,FURH-PFH-NPs的粒径在72h内无明显增大,而72h后粒径才缓慢增大。用2.0W/cm~2超声功率LIFU作用后,2min时FURH-PFH-NP观察到相变,随时间延长出现了大量相变的微泡。新型FURH-PFH-NPs的单线态氧产量检测结果:在激光辐照6min后消耗DPBF十分明显,在10min消耗DPBF约85%,通过间接检测新型FURH-PFH-NPs具有高效单线态氧产生量。结论成功制备了造影剂FURH-PFH-NPs,形态呈球形,其上镶嵌有UCNPs-RB颗粒,大小均一,稳定性好,具有较好的声致相变和产生单线态氧的能力。第二部分载UCNPs-RB相变型纳米粒体外实验研究目的观察FURH-PFH-NPs的细胞毒性并筛选适宜给药浓度、超声作用参数及激光辐照与FURH-PFH-NPs结合作用后对卵巢癌细胞SKOV3的影响,然后研究这种造影剂在体外靶向性和光动力治疗性能,最后研究其体外增强超声、光声和荧光成像的能力。方法(1)通过MTT法对FURH-PFH-NPs细胞毒性的检测来筛选出给药浓度,接着进行超声作用及激光参数的筛选,并通过流式细胞仪及荧光显微镜观察初步评价其靶向性及光动力治疗的效果。(2)进行FURH-PFH-NPs体外超声成像研究,观察FURH-PFH-NPs在不同功率的超声作用下经过不同的作用时间所得到的超声成像效果,进行统计分析。(3)探索其光声成像性能,并分析成像原理及定量分析。最后研究了FURH-PFH-NPs荧光成像的能力,并观察超声作用前后其荧光成像的能力。结果(1)根据细胞活性实验结果(MTT法)选择FURH-PFH-NPs浓度为100μL/ml,超声参数是2W/cm2,2min,激光参数是0.2W/cm2120s,完成后续的细胞实验。(2)不同因素对细胞活性的影响,加入FURH-PFH-NPs后各组细胞的活力均受到一定的影响,对细胞抑制率较不加FURH-PFH-NPs组明显升高,提示FURH-PFH-NPs抑制了细胞的增殖。流式细胞检测的结果是凋亡以早期(右下)和晚期(右上)细胞凋亡率为其表现。在免疫荧光下看到经FURH-PFH-NPs处理后的细胞内细胞核体积增大,部分破碎,细胞核内的染色质浓缩、分布不均匀,且边缘化,这说明细胞处于凋亡的不同时期。提示FURH-PFH-NPs加上超声和激光后具有明显促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长的作用。(3)体外光动力作用的评价结果是通过用DCFH-DA孵育后的荧光强度来判断其单线态氧的产生能力。分为:FURH-PFH-NPs+US+Laser、FURH-PFH-NPs+US、FURH-PFH-NPs+Laser组。使细胞内产生ROS最强的是FURH-PFH-NPs+US+Laser组。FURH-PFH-NPs体外的靶向性激光共聚焦结果显示叶酸具备高效连接其受体的能力,通过图片展示了叶酸与细胞的特异性结合。(4)体外成像结果显示:灰阶超声回声强度以2.0W/cm2最强,并且与其他功率相比具有显著性差异,2.0W/cm2的超声回声强度在不同作用时间1min、2min、4min无显著性差异;作用2min的灰阶超声和造影模式均表现为平均声强最大。FURH-PFH-NPs通过活体荧光成像系统激发波长为980nm,发射波长为650nm进行荧光成像,用RB浓度计算,从0.125mg/ml-2mg/ml均可以出现荧光成像,并且有非常明显的浓度正相关性。FURH-PFH-NPs具有的光声成像性能,在705nm有一个特异吸收峰,PA值在3.4a.u,发现光声强度与浓度之间呈线性正相关。结论FURH-PFH-NPs具有肿瘤细胞靶向性,可产生良好的光动力治疗效果,有良好的增强体内外超声、光声和荧光对多模态成像的性能。第三部分载UCNPs-RB相变型纳米粒体内实验研究目的研究FURH-PFH-NPs纳米粒在体内的超声/光声/荧光三种成像性能;以体内超声/光声/荧光三种成像做指导研究纳米粒在超声作用下肿瘤靶向性,筛选适宜治疗时间窗;注射FURH-PFH-NPs后超声作用后用激光照射肿瘤治疗SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤,观察这种方法的光动力和化疗治疗效果并评价。方法(1)应用SKOV3卵巢癌细胞系对裸鼠进行皮下移植成瘤。(2)首先体内荧光成像初步筛选治疗时间窗,然后利用荷瘤裸鼠的超声成像特点进一步验证治疗时间窗:注射靶向组与非靶向组纳米粒后连续进行观察,观察时间点为:即刻、0.5h、1h、6h、12h、24h、48h。研究其超声成像性能及定量分析,最后再研究纳米粒体内光声成像性能。(3)为了研究体内三模态成像能否指导纳米粒体内肿瘤靶向性,进行了瘤体内纳米粒分布的病理实验:将30只荷瘤裸鼠随机分为靶向组与非靶向组,分别经鼠尾静脉注射FURH-PFH-NPs和URH-PFH-NPs,并于注射后的0.5h、1h、6h、12h、24h脱颈处死裸鼠,迅速将瘤体取出制成40um病理切片,用显微镜观察瘤体病理切片内纳米粒分布的状态。(4)靶向治疗实验:将20只荷瘤裸鼠随机分为4组:FURH-PFH-NPs+US+Laser组、FURH-PFH-NPs+Laser组、HCPT组、生理盐水组。14天隔日进行相应处理并测量肿瘤的大小,计算肿瘤生长曲线和抑瘤率;14天后处死裸鼠、取出瘤体行免疫组织化学方法检测肿瘤组织细胞中增殖指标PCNA和缺氧指标HIF-1α表达情况。结果(1)荧光成像显示,注射FURH-PFH-NPs后,荷瘤裸鼠肿瘤内高峰期在6h时开始出现,12h逐渐下降;(2)注射FURH-PFH-NPs后,低强度聚焦超声作用前肿瘤内灰阶及超声造影模式均呈无回声,超声作用后两种成像模式均出现回声增强,利用回声强度定量分析发现回声增强在6h达峰,并持续约6h;(3)纳米粒在瘤体内分布实验:在不同时间点,靶向组肿瘤病理切片均有FURH-PFH-NPs分布,1h出现,在6h瘤体内FURH-PFH-NPs分布最多;而非靶向组仅有极少量FURH-PFH-NPs分布。(4)靶向治疗实验:FURH-PFH-NPs组裸鼠肿瘤生长指数最低、抑瘤率最高。(5)免疫组化结果:与对照组相比,FURH-PFH-NPs组的增殖指标PCNA、缺氧指标HIF-1α表达均减低。结论(1)FURH-PFH-NPs具有良好的超声/荧光/光声成像能力;(2)在超声作用下,6h高峰聚集于裸鼠卵巢癌移植瘤内。(3)在激光的辐照下发挥光动力治疗与化疗的协调作用,期望这种协同治疗方式可以成为治疗恶性肿瘤新途径。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.31
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