STBM在子痫前期肾脏损伤作用的研究
发布时间：2017-04-01 18:12
本文关键词：STBM在子痫前期肾脏损伤作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：背景和目的:子痫前期(preeclampsia PE)的特点是妊娠后期(20周)新出现高血压和蛋白尿,在我国的发病率为9.4%-10.4%1。PE常并发急性肾衰竭、子痫前期肾病、胎盘早剥、脑水肿、HELLP综合征等。此外,由PE引发的多脏器功能紊乱对母儿造成严重的不良影响,同时增加了巨大的社会成本。目前尚无有效的治疗方法,唯一的途径是尽快结束分娩。PE的发病机制不明。目前已经被普遍认同的是子痫前期的两阶段模型:第一阶段:由于遗传、免疫因子的异常调节等因素至绒毛外滋养细胞侵入不足和子宫螺旋动脉重塑障碍,引发胎盘浅着床为发病提供了解剖学基础;第二阶段:子宫胎盘循环异常,局部缺血缺氧损伤,增强氧化应激,增加了胎盘源性不良因子的释放入母血循环,导致母体内皮细胞功能紊乱和过强的免疫应答。这一切造成了PE的临床表现如:蛋白尿、高血压等。其中,胎盘源性不良因子的释放是发病的重要环节。合体滋养细胞微粒(STBM)是合体滋养细胞(Syncytiotrophoblast ST)凋亡或被激活时产生的带膜囊泡状结构,正常妊娠时外周血中也有少量的释放,是重要的胎盘源性不良因子之一。研究表明:STBM的释放除了引发机体凝血-纤溶平衡、激发母体系统性炎症以外,对血管内皮细胞亦有损伤。肾脏损伤在PE中较常见,表现为蛋白尿(proteinuria)增多、血肌酐(serum creatinine)等代谢产物升高及肾小球病理改变,是妊娠期合并肾脏疾病的主要原因。临床上将子痫前期时出现蛋白尿和肾功能不全,称为子痫前期肾病2。PE时,一方面全身微小动脉痉挛(包括肾小球小动脉收缩)、肾小球滤过屏障被破坏,致肾小球滤过率降低,血肌酐、尿素氮等代谢产物不能及时排出,蓄积在体内表现为肾脏功能的损伤;另一方面,肾小球滤过屏障的损伤,血浆蛋白从滤过屏障渗出增多超过肾小管重吸收的范围,产生肾小球性蛋白尿。蛋白尿不仅是子痫前期的诊断标准之一,更是PE严重程度(轻度PE:尿蛋白≥0.3g/24h;重度PE:尿蛋白≥5g/24h)的重要依据,它的产生反应肾小球滤过屏障的损害。肾脏血供丰富,肾小球是一个高度专业化的血液率过器,其本质是一团毛细血管网,极易受到血管收缩和内皮损伤的影响。血管内皮细胞是体内分布最广泛的细胞之一。它不仅有屏障功能,还是重要的内分泌器官。可以分泌促凝/抗凝因子(纤维蛋白溶酶原)、血管活性物质(内皮素(et)、一氧化碳(no)、前列环素(pgi)、血管紧张素(at))、细胞粘附分子、白介素等,参与调节血管的舒张、凝血/抗凝的平衡、免疫应答、炎症等3。电镜下观察pe患者的肾脏组织可见肾小球内皮细胞肿胀、内皮窗结构被破坏,而足细胞裂孔膜并无明显的改变,提示了内皮细胞在pe肾脏病变中起重要作用4。我们通过模拟pe时外周血中stbm升高的情况,通过次c57小鼠制备类子痫模型,检测小鼠肾脏功能及病理组织形态损伤的情况。从stbm致肾小球内皮细胞(glomerularvascularendothelialcellgvec)损伤入手,检测其增殖、凋亡和屏障功能的改变。为临床pe肾损伤提供新的治疗的靶点和思路。材料和方法:(一)stbm上调对孕鼠肾脏功能及肾脏病理形态的影响1.研究对象选取第三军医大学大坪医院实验动物中心的c57bl/6小鼠处鼠(8周龄)。2.机械法提取孕17天小鼠stbm。麻醉后反复消毒,剪开孕囊,将分离的胎盘迅速置于pbs(4℃)中。反复漂洗至pbs无色,去除残留的蜕膜组织。将胎盘剪成细颗粒,置于含有双抗的nacl溶液中,4℃震荡过夜。次日离心:1000g,10min,4℃;弃沉淀离心:10000g,10min,4℃;弃沉淀离心:100000,60min,4℃。以5%蔗糖pbs重悬沉淀,㧟20℃冰箱保存。3.stbm蛋白浓度的测定。严格按照bca蛋白浓度测定试剂盒说明进行操作。4.透射电子显微镜观察鉴定stbm。stbm稀释45倍,滴液法制片,待样品干燥后上机观察。5.分组处理孕鼠。将孕鼠分为stbm组、pbs组、对照组。从孕8天起至孕17天,每天分别向孕鼠尾部注射stbm、pbs和不予处理。6.分别收集三组孕鼠的血液、尿液及肾脏标本。将孕17天的三组孕鼠分别置于小鼠代谢笼中,禁食,给予充足的饮水,24小时后收集尿液,记录尿量,上机测定m-tp、m-tp/cr,根据m-tp和尿量计算24hu-tp。孕17天时,挖眼取血,将血液收集到1.5ml的ep管中,离心:3000r/min,15min。取血浆测定scr、bun、cys-c。分别取三组孕17天小鼠的肾脏组织,制备冰冻切片,光镜下观察。(二)stbm对肾小球内皮细胞的影响1.严格按照纳入标准和排出标准选择大坪医院重度子痫前期患者的胎盘组织(2013.12-2015.04)。2.提取人stbm。无菌条件下剪取胎盘母体中央面组织块(1cmx1cmx1cm大小),置于冰pbs中,反复漂洗至pbs无色,去除蜕膜组织,将绒毛剪成碎屑,置于无菌培养皿中培养72小时。离心:1000g,20min,4℃;弃沉淀离心:10000g,20min,4℃;弃沉淀超速离心:100000g,60min,4℃;弃上清,用5%蔗糖pbs液重悬沉淀,-20℃冻存。3.hrgec的培养:细胞复苏、细胞传代、细胞冻存。4.检测stbm对hrgec增殖能力的影响。时间梯度:制备hrgec混悬液,按每孔约2000个细胞计数,滴入96孔避光板中,移至细胞培养箱培养24小时。向各组加入等量stbm,分别干预6h、12h、24h、48h后终止。每孔加入cck-810μl,培养3小时酶标仪测定吸光度值(430-490mn)。浓度梯度:将stbm的浓度分别调整为50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml,按上述方法分组检测吸光度值。5.检测stbm刺激后hrgec凋亡情况(tunel法)。制备细胞爬片,室温下吹干、固定。分别向stbm组、h2o2组、对照组内加入stbm、h2o2、完全培养基,作用24小时。固定、封闭、通透后用事先制备好的tunel反应液按说明加入各组玻片上,暗室反应1小时。pbs漂洗3次后dipa染细胞核。于荧光显微镜下观察。6.westonblot检测stbm刺激后hrgec凋亡情况。7.transwell小室检测stbm对hrgec屏障功能的损伤。按照每孔1x106个细胞将hrgec接种在transwell上室(0.4μm)的纤维聚碳酸酯膜上,transwell小室置于24孔板中,培养至细胞完全融合。分别向stbm组、fbs组、对照组transwell上室中加入stbm(100ng/ml)、fbs、完全培养基。分别于24h、72h后向各组transwell上室中加入fitc-bsa。1小时后收集各组transwell下室中液体,上机检测。结果:(一)stbm上调对孕鼠肾脏功能及肾脏病理形态的影响1.stbm蛋白浓度为0.67-1.28mg/ml,平均值为(0.87±0.24)mg/ml。2.透射电镜下(hitachi-7500)观察stbm呈现为膜性囊泡状结构,与报道的人stbm(0.1μm-2μm)的直径相近。3.尿液检测:与pbs组和对照组相比,stbm组24hu-tp、m-tp/cr明显升高。(p0.01)4.血液检测stbm组孕鼠bun、scr、cys-c均显著升高。(p0.05)5.stbm组肾小球体积增大,内皮细胞肿胀,肾小管呈轻度云雾状变性。对照组和PBS组肾脏组织无上述病理改变。(二)STBM对肾小球内皮细胞的影响1.随着STBM浓度的加大,作用时间的增加,对HRGEC增殖的抑制作用逐渐增强。2.通过Tunel实验和PI3K/AKT信号通路发现STBM促进HRGEC凋亡。3.通过Transwell小室的检测,分析STBM可能是致HRGEC屏障功能受损的原因之一。结论:1.小鼠STBM外周血回输后,24h尿蛋白、尿蛋白/肌酐比值明显升高,外周血肌酐、尿素氮、胱抑素-C显著上调,提示外周血STBM浓度上调损伤肾脏屏障功能。2.小鼠STBM外周血回输引起肾小球损伤等肾脏组织病理形态改变,可能是肾脏屏障功能受损的主要病理生理机制。3.STBM对肾小球内皮细胞的作用:抑制增殖,促进凋亡及对肾小球屏障功能损伤,使血管的完整性受损,推测是发生蛋白尿等一系列症状的原因之一。
【关键词】：子痫前期 合体滋养细胞微粒 肾损伤 肾小球内皮细胞 尿蛋白
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.244
【目录】：
- 缩略语表4-6
- 英文摘要6-11
- 中文摘要11-15
- 第一章 前言15-17
- 第二章 STBM上调对孕鼠肾脏功能及肾脏病理形态的影响17-27
- 2.1 材料和方法17-23
- 2.2 实验结果23-25
- 2.3 讨论25-26
- 2.4 小结26-27
- 第三章 STBM对肾小球内皮细胞的影响27-42
- 3.1 材料和方法27-35
- 3.2 实验结果35-40
- 3.3 讨论40-41
- 3.4 小结41-42
- 全文总结42-43
- 参考文献43-46
- 文献综述 子痫前期肾损伤概述46-55
- 参考文献51-55
- 在读期间发表的论著55-56
- 致谢56
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