TRIM50在卵巢癌组织中的表达和在体内外的作用效应及其分子机制的研究

发布时间：2020-09-07 18:50

　　研究背景卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,其中上皮性卵巢癌是最主要的病理类型。上皮性卵巢癌起病隐匿,进展迅速,多数患者初诊时已处于疾病晚期。手术治疗仅对早期卵巢癌较为有效,而多数患者对常规的化疗和放疗不敏感,治疗方法极为有限。因此,寻找卵巢癌新型靶向干预手段具有重要的临床意义。泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)是真核细胞内蛋白质选择性降解的重要途径。UPS由泛素(ubiquitin,Ub)、26S蛋白酶体、E1泛素活化酶、E2泛素结合酶、E3泛素连接酶和DUBs泛素解离酶组成。其中E3泛素连接酶决定了底物的特异性选择,是UPS的关键酶。目前,针对UPS的组成成分开发靶向药物是肿瘤研究的热点。TRIM(tripartite motif-containing protein)蛋白家族是一类RING型E3泛素连接酶,其结构特点是N-端含有环指结构域(RING-finger)、B-box结构域和卷曲螺旋(Coil-coiled)结构域,其C-端结构复杂多变。近年来,TRIM蛋白家族因其独特的结构和强大的生物学功能而受到越来越多的关注。部分TRIM家族成员通过靶向调控原癌或抑癌分子,参与肿瘤的发生与进展。TRIM50是近年发现的TRIM蛋白家族新成员。研究发现,TRIM50参与调控神经系统发育、胃酸分泌以及细胞自噬过程。而TRIM50与肿瘤的相关报道甚少,仅有一篇报道称TRIM50通过降解Snail抑制肝细胞性肝癌的上皮细胞-间充质转化。TRIM50在卵巢癌中的功能至今未见报道。Src蛋白是Src家族激酶(Src family kinases,SFKs)成员之一,是由原癌基因编码的具有酪氨酸激酶活性的非受体蛋白。Src激酶的结构由单一序列(U)、SH3结构域、SH2结构域、连接段、SH1结构域(蛋白酪氨酸激酶结构域)和竣基端调节尾端组成。Src的激活主要由羧基端调节尾端Tyr530的去磷酸化和激酶结构域Tyr419的自磷酸化所调控。Src能够与多种受体酪氨酸激酶和整合素相互结合并被激活,介导细胞信号级联反应,在维持细胞动态平衡过程中发挥关键作用。研究显示,Src激酶在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤中过度表达或高度激活。异常活化的Src过度激活下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt/PKB)以及信号传导及转录激活因子3(STAT3)等信号通路,促进肿瘤增殖、抵抗凋亡、血管生成和侵袭转移等恶性进展。因此,Src是极具潜力的抗肿瘤干预靶点,针对Src的靶向调控研究可为逆转卵巢癌进展提供新策略。本课题检测了卵巢癌组织标本中TRIM50蛋白的表达情况,并分析其临床意义;探讨了 TRIM50对卵巢癌细胞恶性行为的影响,以及对裸鼠卵巢癌异种移植瘤生长的作用效应;并深入探究TRIM50靶向调控Src蛋白的分子机制。第一部分TRIM50在卵巢癌组织中的表达和在体内外的作用效应的研究研究目的:1.检测卵巢癌组织标本中TRIM50蛋白的表达情况,分析其临床意义。2.研究TRIM50对卵巢癌细胞增殖、克隆形成和迁移能力的影响,以及对裸鼠卵巢癌异种移植瘤生长的影响。研究方法:1.研究TRIM50在卵巢癌组织标本中的表达情况及其临床意义应用免疫组织化学染色法(Immumohistochemical staining,IHC)检测67例患者的卵巢浆液性腺癌组织中TRIM50蛋白的表达定位和表达水平,统计学分析TRIM50的表达水平与疾病分期和病理分级的相关性。2探讨TRIM50对卵巢癌细胞系的恶性行为的影响2.1构建TRIM50功能缺失和过表达TRIM50的卵巢癌细胞模型在A2780和SK-OV-3卵巢癌细胞系中瞬时转染TRIM50特异性Si-RNA(Si-TRIM50),以转染无意序列(Si-NC)的细胞和未转染的细胞(Blank)作为对照,以此构建TRIM50功能缺失的卵巢癌细胞模型。在A2780和SK-OV-3细胞系中瞬时转染TRIM50质粒,以转染空载体的细胞和未转染的细胞(Blank)作为对照,构建过表达TRIM50的卵巢癌细胞模型。应用western blot分别验证Si-TRIM50的封闭效率和TRIM50质粒的过表达效率。2.2研究TRIM50对卵巢癌细胞增殖、克隆形成和迁移能力的影响应用CCK-8实验、克隆形成实验和transwell实验分别检测TRIM50对卵巢癌细胞增殖、克隆形成和迁移能力的影响。3.探讨TRIM50对裸鼠卵巢癌异种移植瘤生长的影响3.1构建裸鼠卵巢癌异种移植瘤模型将卵巢癌细胞接种于雌性BALB/c裸鼠(4-6周)的两侧腋下。分别应用SK-OV-3和A2780细胞系构建两种人卵巢癌细胞系来源的裸鼠异种移植瘤模型。3.2研究TRIM50对卵巢癌异种移植瘤生长的影响待裸鼠两侧腋下出现肉眼可见的肿瘤后,在右侧瘤内注射TRIM50质粒(30μg),在左侧瘤内注射空载体(30μg)作为对照,每2天注射一次。定期记录肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。处死裸鼠后取瘤体,比较各组肿瘤的体积和重量。研究结果:1.TRIM50在卵巢癌组织中的表达情况及其临床意义应用IHC检测67例卵巢浆液性腺癌组织标本中TRIM50蛋白的表达定位和表达水平。结果显示,TRIM50主要定位于卵巢癌细胞的胞浆。统计学分析显示,与FIGO Ⅰ期患者的卵巢癌组织相比,FIGO Ⅱ、Ⅲ和ⅣV期患者的卵巢癌组织中TRIM50的表达水平显著下调。与病理呈G1级(高分化)的卵巢癌组织相比,G2级(中分化)和G3级(低分化)的卵巢癌组织中TRIM50的表达水平显著降低。相关性分析显示TRIM50在卵巢癌组织中的表达水平与疾病分期和病理分级呈显著负相关。表明TRIM50的表达下调可能参与了卵巢癌的恶性进展。2.TRIM50对卵巢癌细胞增殖、克隆形成和迁移能力的影响分别构建TRIM50功能缺失和过表达TRIM50的卵巢癌细胞模型,应用CCK-8实验、克隆形成实验和transwell实验检测卵巢癌细胞的恶性行为。结果显示,敲低TRIM50表达后,卵巢癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力显著上调;过表达TRIM50后,卵巢癌细胞的这些恶性行为被显著抑制。表明TRIM50在卵巢癌细胞中发挥抑癌效应。3.TRIM50对裸鼠卵巢癌异种移植瘤生长的影响构建裸鼠卵巢癌异种移植瘤模型,在裸鼠右侧腋下肿瘤中注射TRIM50质粒,在左侧腋下瘤内注射等量空载体作为对照。肿瘤生长曲线显示,与对照组相比,注射TRIM50质粒后卵巢癌肿瘤的生长被显著抑制。剥离瘤体后测量发现注射TRIM50质粒后肿瘤的重量和体积显著小于对照组。表明TRIM50抑制裸鼠卵巢癌异种移植瘤的生长,在体内水平验证了 TRIM50的抑癌效应。研究结论:1.TRIM50在卵巢癌组织标本中的表达水平与卵巢癌临床分期和病理分级呈负相关。2.TRIM50显著抑制卵巢癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力,并显著抑制裸鼠卵巢癌异种移植瘤的生长。第二部分TRIM50对Src蛋白的结合及调控效应的研究研究目的:1.筛选TRIM50的作用靶点,研究TRIM50与靶蛋白Src的直接结合效应以及介导二者结合的结构域。2.探讨卵巢癌细胞中TRIM50对Src蛋白的调控效应,以及TRIM50通过调控Src发挥抑癌效应的机制。研究方法:1.研究TRIM50与Src蛋白的直接相互作用1.1 免疫共沉淀实验(Immunoprecipitation,IP)应用IP实验筛选可能与TRIM50相互结合的原癌或抑癌分子,发现TRIM50与原癌分子Src相互结合,表明Src蛋白可能是TRIM50发挥抑癌效应的作用靶点。1.2共定位实验在卵巢癌细胞中共转染TRIM50与Src质粒,进行免疫荧光实验,应用激光共聚焦显微镜检测TRIM50与Src蛋白的共定位现象。1.3蛋白体外翻译实验通过蛋白体外翻译实验分别合成TRIM50和Src蛋白,应用IP实验检测合成的TRIM50和Src蛋白在体外的直接结合。2.探讨介导TRIM50与Src蛋白相互结合的结构域2.1研究介导TRIM50与Src结合的TRIM50蛋白结构域构建一系列TRIM50结构域缺失的截短体,将Src质粒分别与各个TRIM50截短体共转染入HEK293T细胞中,以共转染Src与野生型TRIM50质粒的细胞作为阳性对照。IP实验检测各TRIM50截短体与Src的结合,研究TRIM50蛋白结构中介导二者结合的结构域。2.2研究介导Src与TRIM50结合的Src蛋白结构域构建一系列Src结构域缺失的截短体,将TRIM50质粒分别与各个Src截短体共转染入HEK293T细胞中,以共转染TRIM50与野生型Src质粒的细胞作为阳性对照。通过IP实验研究Src蛋白结构中介导二者结合的结构域。3.研究卵巢癌中TRIM50对Src蛋白的调控作用3.1 Western blot 实验在卵巢癌细胞中敲低和过表达TRIM50,western blot检测TRIM50、Src及其活化形式p-Src(Tyr419)的蛋白水平,研究TRIM50对Src蛋白水平的调控作用。3.2 放线菌酮(Cycloheximide,CHX)实验在卵巢癌细胞中转染TRIM50质粒,以转染空载体的细胞作为对照,转染24 h后应用CHX阻断细胞内蛋白合成,设立CHX作用时间梯度(0h、2h、4h、6h和8 h),western blot检测Src蛋白的降解趋势,研究TRIM50对Src降解的调控效应。3.3通过检测裸鼠卵巢癌异种移植瘤验证TRIM50对Src的调控效应提取裸鼠卵巢癌异种移植瘤的蛋白,western blot检测瘤体中TRIM50、Src和p-Src(Tyr419)的表达水平,验证肿瘤内TRIM50的过表达效率,应用动物模型验证TRIM50对Src的调控效应。3.4通过检测卵巢癌组织标本验证TRIM50对Src的调控效应应用IHC实验检测卵巢浆液性腺癌组织标本中Src和TRIM50的蛋白水平,统计学分析Src与TRIM50蛋白水平的相关性,应用临床标本验证TRIM50对Src的调控效应。4.研究卵巢癌细胞中TRIM50介导Src蛋白降解的途径真核细胞内蛋白的降解途径主要有溶酶体途径和泛素蛋白酶体途径。在过表达TRIM50的卵巢癌细胞模型中,分别应用MG132和氯喹抑制蛋白酶体和溶酶体活性,western blot检测Src蛋白水平,研究阻断蛋白酶体或溶酶体活性对TRIM50降解Src功能的影响,探讨TRIM50介导Src降解的途径。5.探讨TRIM50通过调控Src在卵巢癌中发挥抑癌效应的机制在过表达TRIM50的卵巢癌细胞中外源性转染Src质粒,应用western blot验证外源性过表达效率,transwell和克隆形成实验检测细胞的迁移和克隆形成能力,通过靶点恢复实验研究TRIM50是否通过负向调控Src发挥抑癌效应。研究结果:1.TRIM50与Src蛋白直接结合的研究1.1 TRIM50与Src蛋白的相互结合应用IP实验筛选可能与TRIM50发生结合的原癌或抑癌分子,结果显示在HEK293T和卵巢癌细胞中TRIM50与原癌分子Src相互结合,TRIM50与外源性和内源性Src蛋白均能发生结合,表明Src可能是TRIM50的作用靶点。1.2 TRIM50与Src蛋白在卵巢癌细胞中的共定位现象在卵巢癌细胞中共转染TRIM50和Src质粒,应用免疫荧光实验和激光共聚焦技术检测发现TRIM50和Src蛋白在卵巢癌细胞中存在共定位现象,进一步验证了 TRIM50与Src的相互结合。1.3 TRIM50与Src蛋白的直接结合在蛋白体外翻译系统中分别合成TRIM50和Src蛋白,IP实验结果显示,在单纯的体外系统中合成的TRIM50和Src蛋白能够发生直接结合。2.介导TRIM50与Src蛋白结合的结构域的研究2.1介导TRIM50与Src结合的TRIM50蛋白结构域构建一系列TRIM50结构域缺失的截短体,将Src质粒分别与各个TRIM50截短体共转染入HEK293T细胞中,进行IP实验。结果显示,B-box2结构域缺失后TRIM50丧失结合Src的功能,表明TRIM50通过B-box2结构域与Src蛋白发生结合。2.2介导Src与TRIM50结合的Src蛋白结构域构建一系列Src结构域缺失的截短体,在HEK293T细胞中共转染TRIM50质粒与各个Src截短体。IP实验结果显示,SH3结构域缺失后Src无法与TRIM50结合,表明Src通过SH3结构域与TRIM50蛋白发生结合。3.卵巢癌中TRIM50对Src蛋白的调控效应3.1 TRIM50对Src蛋白水平的调控效应前期研究证实了 TRIM50与Src蛋白发生直接结合,我们拟进一步探究TRIM50对Src蛋白的调控效应。在卵巢癌细胞中敲低和过表达TRIM50,western blot结果显示,敲低TRIM50表达后,Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平显著上调;过表达TRIM50后,Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平显著下调,表明TRIM50负向调控Src,显著抑制Src活性。3.2 TRIM50对Src蛋白稳定性的调控效应将TRIM50质粒转染入卵巢癌细胞中,以转染空载体的细胞作为对照,应用放线菌酮阻断细胞内蛋白的合成,western blot检测Src蛋白的降解趋势。结果显示,与对照组相比,过表达TRIM50后Src蛋白的降解速率显著上调,表明TRIM50能够降低Src蛋白的稳定性,促进Src蛋白降解。3.3应用裸鼠卵巢癌异种移植瘤验证TRIM50对Src蛋白的负向调控效应Western blot检测裸鼠卵巢癌异种移植瘤中TRIM50、Src和p-Src(Tyr419)的蛋白水平。结果显示,注射TRIM50质粒的肿瘤中TRIM50成功过表达,并且在TRIM50过表达的肿瘤中Src和p-Src(Tyr419)蛋白水平显著下调,这在动物模型水平验证了 TRIM50对Src的负向调控效应。3.4 卵巢癌组织标本中Src与TRIM50蛋白水平的相关性应用IHC实验检测卵巢浆液性腺癌组织标本中Src和TRIM50蛋白的表达水平,统计学分析结果显示Src与TRIM50的表达水平呈显著负相关,这在临床标本水平验证了 TRIM50对Src的负向调控效应。4.卵巢癌细胞中TRIM50介导Src蛋白降解的途径在过表达TRIM50的卵巢癌细胞模型中,分别应用MG132和氯喹阻断蛋白酶体和溶酶体的活性,western blot结果显示,MG132能够阻断TRIM50对Src的降解作用,而氯喹并不影响TRIM50降解Src的功能,表明TRIM50对Src蛋白的降解作用依赖于蛋白酶体途径而非溶酶体途径。5.TRIM50通过调控Src蛋白在卵巢癌细胞中发挥抑癌效应的机制研究基于前期研究证实了 TRIM50的抑癌效应及其负向调控Src的功能,我们拟通过靶点恢复实验探讨TRIM50是否通过负向调控Src发挥抑癌效应。在过表达TRIM50的卵巢癌细胞模型中外源性转染Src质粒。Western blot结果显示各质粒的成功过表达,克隆形成实验和transwell实验结果显示外源性过表达Src能够逆转TRIM50对卵巢癌细胞恶性行为的抑制作用,表明TRIM50通过负向调控Src蛋白在卵巢癌细胞中发挥抑癌效应。研究结论:1.TRIM50直接靶向结合Src蛋白,TRIM50的B-box2结构域与Src的SH3结构域共同介导了二者的结合。2.卵巢癌细胞中TRIM50通过蛋白酶体途径降解Src蛋白,TRIM50通过降解Src发挥抑癌效应。第三部分卵巢癌细胞中TRIM50调控Src的分子机制研究研究目的:1.研究TRIM50对Src蛋白的泛素化修饰作用。2.研究RING结构域在TRIM50泛素化降解Src蛋白和发挥抑癌效应过程中的功能。研究方法:1.探讨TRIM50对Src蛋白的泛素化修饰作用1.1泛索化分析实验在卵巢癌细胞中共转染带HA标签的Ub质粒(HA-Ub)和TRIM50质粒,以共转染HA-Ub与空载体的细胞作为对照,IP实验检测Src的泛素化状态,研究TRIM50对Src的泛素化修饰作用。1.2体外泛素化实验应用蛋白体外翻译系统合成TRIM50和Src蛋白,将合成的TRIM50和Src蛋白与Ub、UBE1、UbcH5a(UBE2D1)、ATP和MgCl2共同孵育,构成体外泛素化系统。Western blot检测Src的泛素化状态,探讨TRIM50的E3泛素连接酶功能。2.检测TRIM50介导Src蛋白泛素化修饰的类型HA-Ub-K48和HA-Ub-K63质粒是泛素突变体载体,除了分别位于第48和63位的赖氨酸残基以外,其他赖氨酸残基均被精氨酸取代。在HEK293T和SK-OV-3细胞中分别将HA-Ub-K48、HA-Ub-K63与TRIM50质粒进行共转染,IP实验检测Src的泛素化状态,研究TRIM50介导Src泛素化修饰的类型。3.研究RING结构域在TRIM50泛素化降解Src和发挥抑癌效应过程中的作用3.1研究RING结构域在TRIM50泛素化修饰Src蛋白过程中的作用将HA-Ub与RING结构域缺失的TRIM50截短体共转染入卵巢癌细胞中,以共转染HA-Ub与野生型TRIM50质粒的细胞作为阳性对照,以共转染HA-Ub与空载体的细胞作为阴性对照,应用IP实验检测Src的泛素化状态,探讨RING结构域在TRIM50泛素化修饰Src蛋白过程中的作用。3.2探讨RING结构域在TRIM50负向调控Src过程中的功能在卵巢癌细胞中转染RING结构域缺失的TRIM50截短体,分别以转染野生型TRIM50质粒的细胞和转染空载体的细胞作为阳性对照和阴性对照。Western blot检测细胞的Src、p-Src(Tyr419)蛋白水平,研究RING结构域在TRIM50负向调控Src过程中的功能。3.3探讨RING结构域在TRIM50发挥抑癌效应过程中的作用分别在卵巢癌细胞中转染RING结构域缺失的TRIM50截短体、野生型TRIM50质粒和空载体对照。Transwell和克隆形成实验检测细胞的迁移和克隆形成能力,研究RING结构域在TRIM50发挥抑癌效应过程中的作用。研究结果:1.卵巢癌细胞中TRIM50介导Src蛋白发生泛素化修饰的研究1.1 TRIM50介导Src蛋白泛素化修饰的功能将HA-Ub与TRIM50质粒共转染入卵巢癌细胞中,以共转染HA-Ub与空载体的细胞作为对照,IP实验检测Src的泛素化修饰状态。结果显示TRIM50能够将泛素链添加到Src蛋白上,介导Src发生泛素化修饰。1.2 TRIM50的E3泛素连接酶活性的检测将在蛋白体外翻译系统中合成的TRIM50和Src蛋白与Ub、UBE1、UbcH5a(UBE2D1)、ATP和MgCl2共同孵育,构成体外泛素化系统,western blot检测Src的泛素化状态。结果显示在单纯的体外系统中TRIM50能够将泛素链添加在Src蛋白上,表明TRIM50是直接介导Src泛素化的E3泛素连接酶。2.TRIM50介导Src蛋白泛素化修饰的类型K48和K63位泛素化修饰是机制较明确的泛素化修饰类型。在HEK293T和SK-OV-3细胞中,将TRIM50质粒分别与HA-Ub-K48和HA-Ub-K63质粒进行共转染,IP实验检测Src的泛素化状态。结果显示,TRIM50介导Src发生K48位泛素化修饰,进一步验证了 TRIM50通过泛素蛋白酶体途径介导Src的降解。3.RING结构域在TRIM50泛素化降解Src和发挥抑癌效应过程中的功能研究3.1 RING结构域在TRIM50泛素化修饰Src蛋白过程中的作用将HA-Ub分别与RING结构域缺失的TRIM50截短体、野生型TRIM50质粒(阳性对照)和空载体(阴性对照)共转染入卵巢癌细胞中,IP实验检测Src的泛素化状态。结果显示RING结构域缺失后TRIM50无法为Src蛋白加上泛素链,表明TRIM50通过RING结构域介导Src的泛素化修饰。3.2 RING结构域在TRIM50负向调控Src过程中的作用在卵巢癌细胞中转染RING结构域缺失的TRIM50截短体,分别以转染野生型TRIM50质粒的细胞和转染空载体的细胞作为阳性对照和阴性对照,western blot检测Src和p-Src(Tyr419)蛋白水平。结果显示,TRIM50的RING结构域缺失突变体失去下调Src和p-Src(Tyr419)的功能,表明TRIM50依赖RING结构域发挥负向调控Src的作用。3.3 RING结构域在TRIM50发挥抑癌效应过程中的功能分别在卵巢癌细胞中转染RING结构域缺失的TRIM50截短体、野生型TRIM50质粒和空载体对照,transwell和克隆形成实验检测细胞的迁移能力和克隆形成能力。结果显示,RING结构域缺失后,TRIM50失去了抑制卵巢癌细胞恶性行为的功能,表明TRIM50的抑癌效应是依赖RING结构域而发挥的。研究结论:1.卵巢癌细胞中TRIM50通过E3泛素连接酶活性介导Src蛋白发生K48位泛素化修饰,通过泛素蛋白酶体途径降解Src蛋白。2.卵巢癌细胞中TRIM50依赖RING结构域泛素化降解Src蛋白和发挥抑癌效应。课题的创新性和局限性课题的创新性:1.对TRIM50在卵巢癌中的功能进行研究,并分析TRIM50的表达水平与疾病分期和病理分级的相关性,为探索卵巢癌新型治疗靶标和预后评估指标提供依据。2.提出TRIM50对Src蛋白的靶向抑制效应,揭示了 TRIM50通过泛素蛋白酶体途径降解Src蛋白,为探究Src的调控机制和开发新型Src抑制剂奠定基础。3.探索了 TRIM50靶向调控Src和发挥抑癌效应的关键结构域,为明确TRIM50的结构功能特点和设计基于TRIM50结构域的小分子化合物提供理论依据。课题的局限性:1.本课题纳入的临床卵巢癌标本数量有待进一步扩大,从而使不同分期的标本数分布更均。组织标本来源年份较早,故采用G1、G2和G3病理分级方法。2.TRIM50其他结构域(Coiled-coil、PRY-SPRY结构域)的功能有待研究。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.31
【部分图文】：

卵巢癌组织,临床意义,表达水平,博士学位论文

逦山东大学博士学位论文逦逡逑组织相比，ＦＩＧＯ邋ＩＩ、ＩＩＩ和ＩＶ期患者的卵巢癌组织中ＴＲＩＭ５０蛋白水平显著下调逡逑（尸＜０．０５，图１Ａ－Ｂ，表２）。与病理呈Ｇ１级（高分化）的卵巢癌组织相比，逡逑Ｇ２级（中分化）和Ｇ３级（低分化）的卵巢癌组织中ＴＲＩＭ５０的表达水平显著逡逑下调（户＜０．００１，图１Ｃ－Ｄ，表２）。相关性分析显示ＴＲＩＭ５０在卵巢癌组织中的逡逑表达水平与疾病分期和病理分级呈显著负相关＜０．０５，邋Ｐ＜０．０１，表３）。表明逡逑ＴＲＩＭ５０的表达下调可能参与了卵巢癌的恶性进展。逡逑

卵巢癌细胞,过表达,封闭效率

载体的细胞和未转染的细胞（Ｂｌａｎｋ）作为对照，构建过表达ＴＲＩＭ５０的卵巢癌逡逑细胞模型。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ实验分别验证Ｓｉ－ＴＲＩＭ５０的封闭效率和ＴＲＩＭ５０质粒的逡逑过表达效率（图２Ａ－Ｂ）。逡逑２．２逦ＴＲＩＭ５０对卵巢癌细胞增殖能力的影响逡逑应用ＣＣＫ－８实验检测ＴＲＩＭ５０对Ａ２７８０和ＳＫ－ＯＶ－３细胞增殖能力的影响。逡逑结果显示，与对照组相比，敲低ＴＲＩＭ５０表达后卵巢癌细胞的增殖水平显著上调逡逑（尸＜０．００１，图２Ｃ）；过表达ＴＲＩＭ５０后卵巢癌细胞的增殖水平明显低于对照逡逑组（尸＜０．００１，图２Ｄ）。表明ＴＲＩＭ５０显著抑制卵巢癌细胞的增殖能力。逡逑Ａ逦８逡逑＾２７８０逦ＳＫ－ＯＶ－３逦Ａ２７８０逦ＳＫ－ＯＶ－３逡逑Ｂｌａｎｋ逦？逦Ｂｌａｎｋ逦？逦Ｂｌａｎｋ逦？逦Ｂｌａｎｋ逦？逦．逡逑Ｓ？＊ＮＣ逦？逦８Ｍ４Ｃ逦？逦Ｆｌａｇ－ｐＣＭＶ逦？逦Ｆｌａｇ＾ｐＣＭＶ邋．逦？逦？逡逑８＾ＴＲＩＭ５０逦？逦？逦ＳＩ－ＴＲＩＭ５０逦？逦ＦＩ？ｇ－ＴＲＩＭＳＯ邋？逦？逦？逦Ｆｌａｇ－ＴＲＩＭ５０邋■逦？逡逑ＴＷＭ５０邋■■运．５５ｋ0邋ＴＲＩＭ５０逦５５ＫＤ逦Ｆｌａｇ邋｜逦ｊ＾ｊ．ＳＳＫＤ邋Ｆｌａｇ邋｜逦＾Ｆ｜－５５ＫＤ逡逑ｐ－ａｃｔｌｎ逦ｍｍｍｒ邋？？？邋４２ＫＤ邋ｐｅｃｔｉｎ逦ＭＶ邋？邋４２Ｋ０逦ｐ－ｏｃｔｌｎ逦．４２ＫＤ邋ｐｅｃｔｉｎ逡逑Ｃ逦Ｄ逡逑Ａ２７８０逦ＳＫ－ＯＶ－３逦Ａ２７８０逦ＳＫ－ＯＶ－３逡逑＊￣逦２．0

卵巢癌细胞,克隆形成,细胞克隆

应用克隆形成实验检测ＴＲＩＭ５０对Ａ２７８０和ＳＫ－ＯＶ－３细胞克隆形成能力的逡逑影响。结果显示，敲低ＴＲＩＭ５０表达后形成的细胞克隆数明显增多（Ｐ邋＜０．０５，逡逑图３Ａ）；过表达ＴＲＩＭ５０后形成的细胞克隆数明显减少（ＰＯ．ＯＳ，户＜０．０１，图逡逑３Ｂ）。表明ＴＲＩＭ５０显著抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力。逡逑Ａ逦Ｂｌａｎｋ逦Ｓｉ－ＮＣ逦ＳＩ－ＴＲＩＭ５０逡逑ａ邋ｉ逡逑ＳＫ＾ｆｒ！Ｗ＇逡逑Ｂ逦Ｂｌａｎｋ逦Ｍｏｃｋ逦ＴＲＩＭ５０逡逑ｗ邋？逦５邋ＷＭ邋５邋0Ｕｉ！ｕ逡逑图３邋ＴＲ１Ｍ５０对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。逡逑（Ａ）

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