基于蛋白质芯片的PCOS非胰岛素抵抗患者血清生物标记物的探究

发布时间：2020-09-14 09:34

　　 目的1.寻找PCOS伴IR患者与PCOS伴Non-IR患者基本临床特征及实验室指征差异。利用蛋白质组学相关技术探索两者血清差异蛋白,经筛选和验证,鉴定出与PCOS伴Non-IR密切相关的蛋白质。2.建立PCOS-IR/Non-IR大鼠模型,进一步验证人血清蛋白质芯片初筛结果及ELISA验证结果。从临床和基础两个层面,为未来PCOS伴Non-IR发病机制的探索提供依据。方法1.以2017年10月~2018年12月时间范围内就诊于兰州大学第二医院生殖医学科不孕不育门诊,且被初次诊断为PCOS的育龄期患者为实验组,同时募集于门诊体检的月经周期规律且已正常生育的育龄期非PCOS女性为对照组。最终获得初诊PCOS患者157例,对照组女性41例,在征得知情同意的前提下所有参与者均留取常规检查后剩余血清样本,-80℃保存。根据HOMA-IR(≥2.69)将初诊PCOS患者分为IR组以及Non-IR组,最终实验分组为Control 41例,IR组102例以及Non-IR组55例,对比分析三组患者的基本临床特征和实验室指征。利用高通量蛋白质芯片技术(包涵了640种细胞因子)对比检测Control 1、Control2(作为技术重复)、IR组以及Non-IR组各组之间部分样本混样血清的蛋白表达,通过技术重复计算出SD值,以差异≥3倍SD值为卡值标准,分析数据并筛选出在IR组同Non-IR组血清中显著差异表达的蛋白。后续进行扩大临床样本量验证研究,采用ELISA试剂盒进行检测。采用Graphpad prism 6.0、R 3.5.1软件进行数据可视化。利用Cluster3.0软件进行蛋白质的聚类分析,数据结果采用均数±标准差(?x±s)呈现。通过SPSS22.0统计软件进行相关数据的统计分析,以p0.05表示结果具有统计学意义。2.通过DEHA(脱氢表雄酮)(6mg/100g)SD大鼠颈部皮下注射20天诱导PCOS模型。通过对大鼠体重、阴道涂片、卵巢HE染色、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIN)以及性激素测定评估模型,根据HOMA-IR(≥2.8)进行PCOS大鼠IR组和Non-IR的分组。利用ELISA法对比检测Control组、IR组以及Non-IR大鼠血清蛋白质的表达,旨在从PCOS整体动物水平进一步验证前述通过人血清样本蛋白质芯片所筛选出的与PCOS Non-IR密切相关的蛋白质分子。利用Graphpad prism 6.0软件进行绘图。数据结果采用均数±标准差(?x±s)表示。通过SPSS22.0统计软件对实验数据进行统计分析,p0.05表示结果具有统计学意义。结果1.Control组、初诊PCOS IR组以及初诊Non-IR组患者基本临床特征和实验室指征分析本研究最终纳入了157例初诊PCOS患者,Control组41例,平均年龄为26.29±3.38岁。根据HOMA-IR(≥2.69),157例初诊PCOS患者被分为初诊IR组102例,平均年龄为24.92±3.48岁,初诊Non-IR组55例,平均年龄为24.93±3.22岁,患者年龄无显著性差异。相对于Control组女性规律的月经周期而言,PCOS IR和Non-IR患者主要表现为月经周期延长或紊乱。超声检查显示PCOS IR和Non-IR患者绝大部分均表现为双侧PCO。与Control组相比,PCOS IR组和Non-IR组的LH、LH/FSH以及T水平均升高,且差异具有统计学意义(p0.05),而IR组与Non-IR组之间无显著差异。同Control组和Non-IR组相比,IR组空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIN)以及HOMA-IR均显著升高(p0.05);Non-IR组FBG显著高于Control组(p0.05),而两组在FIN和HOMA-IR之间无显著性差异。比较三组之间的BMI发现,IR组患者中肥胖患者约占34.3%,Non-IR组中肥胖患者约占5.5%,而Control组女性的BMI基本均处于正常范围(18.5~22.9kg/m~2)。2.基于蛋白质芯片的PCOS Non-IR组血清差异蛋白的筛选与验证2.1 Non-IR组差异蛋白的筛选结果对蛋白质芯片结果进行重现性分析、PCA分析、k-means cluster聚类分析、t-test差异蛋白分析以及差异蛋白的功能学分析,最终同Control组和IR组相比较,我们筛选出了10种在Non-IR组中显著差异表达且具有重要临床诊疗意义的蛋白,包括Mer、Calcitonin、CA125、Procalcitonin、CA19-9、IL-1 F8、Pepsinogen II、CEA、AFP和CA15-3。通过功能学分析发现其中的CA125、CA19-9、CA15-3、CEA以及AFP这五种蛋白均是与肿瘤发生密切相关联的血清肿瘤标记物。根据标准曲线,计算并统计这五种蛋白的血清浓度。结果发现,同Control组和IR组比较,Non-IR组血清CA125、CA19-9、CEA以及AFP均显著升高(p0.05);对比Control组,IR组和Non-IR组血清CA15-3均显著升高(p0.05),而两者之间无显著性差异。2.2扩大样本量的单样本ELISA验证结果根据患者临床信息对其血清样本进行筛选,最终用于进一步验证芯片结果的样本量为:Control组41例,IR组102例,Non-IR组55例。对比Control组和IR组,Non-IR组血清CA125、CA19-9、CEA以及AFP均显著升高(p0.05),而Control组和IR组比较无显著差异;对比Control组,IR组和Non-IR组CA15-3显著增加(p0.05),而IR组和Non-IR组之间无显著差异。3.PCOS大鼠模型的评估以及血清ELISA的验证结果3.1 PCOS大鼠模型的评估在给药第11天,对比Control组,IR组以及Non-IR组大鼠体重均明显增加(p0.05),而IR组和Non-IR组之间无显著差异;在给药第14、17和20天这三个时间点,对比Control组,IR组和Non-IR组均呈现出体重的显著增加(p0.05),且IR组较Non-IR组体重增加更加显著(p0.05)。通过阴道涂片观察阴道细胞学改变评估大鼠动情周期的变化,对比Control组,IR组和Non-IR组具备完整动情周期的大鼠比例均显著下降,IR组约为18.2%,Non-IR组约为16.7%,而Control组中各大鼠的动情周期均正常。与Control组相比,IR组和Non-IR组卵巢湿重均显著增加(p0.05),IR组和Non-IR组之间无显著差异。通过卵巢HE染色,对比Control组,IR组和Non-IR组初级卵泡(PF)的比例增加显著(p0.05),而IR组和Non-IR组形成的窦卵泡(AF)以及黄体(LH)的比例显著降低(p0.05);IR组和Non-IR组两组之间在PF、AF以及LH的形成上均无显著差异。与Control组和Non-IR组比较,IR组空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FIN)以及HOMA-IR均显著升高(p0.05);Non-IR组较Control组FBG显著升高(p0.05),Non-IR组和Control组在FIN以及HOMA-IR水平上均无显著性差异。与Control组比较,IR组和Non-IR组E2和T水平均显著增加(p0.05),两组间无显著性差异。三组在血清P、PRL、LH、FSH、LH/FSH水平上均无显著差异。3.2 Control组、IR组以及Non-IR组大鼠血清肿瘤标记物的验证结果与Control组相比,IR组和Non-IR组血清AFP水平均显著升高(p0.05),且Non-IR组较IR组升高更为显著(p0.05)。而三组之间在CA125、CA19-9、CA15-3以及CEA的水平上均未见显著性差异。结论1.育龄期PCOS患者多表现为月经周期延长,并通常伴有胰岛素抵抗和高雄激素血症,PCOS胰岛素抵抗患者中肥胖患者占比更高,PCOS患者多表现为双侧卵巢的多囊样改变。2.PCOS Non-IR女性多种血清肿瘤标记物的的显著上调,并结合PCOS动物水平的验证研究,提示PCOS Non-IR女性患者罹患子宫内膜癌的风险增加。3.本研究为临床上对于扩展PCOS Non-IR患者的规范诊疗内容以及加强后期的随访工作的重要性提出有意证据。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R711.75
【部分图文】：

占 5.5%；而 Control 组女性的 BMI 基本均处于正常范围。本研究结果显示，超重或肥胖常常是 PCOS 患者伴随的重要临床特征之一，且在 PCOS 伴胰岛素抵抗患者中表现更为明显。2.3.2 血清蛋白质芯片检测结果的分析2.3.2.1 蛋白芯片检测的原理示意图蛋白质芯片的检测原理可以简单地概括为基于抗原抗体特异性的非共价结合，检测方法主要有双抗体夹心法和样品标记法。本研究中所利用的蛋白质芯片技术主要采用了双抗体夹心法，该方法是将捕获抗体预先固定在固相载体上，加入需要检测的生物样品并进行孵育反应，通过生物样品中特异性抗原与捕获抗体的结合，然后加入生物素标记的检测抗体一起孵育，最后通过 HRP（Horseradisperoxidase）-链霉亲和素与化学发光底物作为信号检测，检测出生物样品的荧光值，并最终计算出生物样品中每种被检测细胞因子的浓度。检测原理如图 2-3 所示。

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本文编号：2818010