前列腺素及其受体在月经发生中对子宫内膜崩解脱落作用机制的研究

发布时间：2020-09-25 19:13

　　月经是包括人类等高等灵长类以及少数其它胎盘动物所特有的,子宫内膜发生周期性脱落的生理现象。分析子宫内膜发生周期性崩解剥脱出血,是理解异常出血机制和寻找治疗异常出血策略的关键所在。月经周期占据着妇女生育期的大部分时间,对女性生殖健康具有十分重大的意义。经典的月经发生假说认为月经周期分泌晚期,孕酮的撤退致使多种前列腺素PGs(Prostagladins)的产生,进而导致子宫内膜螺旋动脉的收缩而造成子宫内膜崩解出血。PGs在月经发生中的主导作用是这一假说成立与否的关键。虽然早在1957年,Pickles首次在经血中也检测到了PGs的存在,然而PGs在月经发生中的主导作用存在争议。有研究报道显示PGs与灵长类特有的月经发生具有始动作用。主要包括以下几点:1)在人的经血中,检测到了脂溶性的血管活性物质,最终认为前列腺素E2(ProstagladinsE2,PGE2)和前列腺素 2α(ProstagladinsF2α,PGF2α);2)PGE2和 PGF2α在子宫内膜中存在,且在分泌晚期和月经期中显著增加;3)在人的子宫腔内,注射PGF2α可以导致子宫的收缩;4)PGs的限速合成酶环氧合酶(COX),其抑制剂NSAIDs能够减少月经过多妇女的出血。有些观点确认为PGs对月经发生不具有始动作用[1]。本研究以在小鼠月经样模型和永生化的人子宫内膜基质细胞,这两个水平上,探讨了孕酮撤退后PGs和PGs受体在月经发生过程中的调控关系。建立小鼠月经样模型,P4撤退的0～24h,探讨PGs和PGs受体在崩解期的表达和作用。发现PGE2和PGF2α均有所增加,而且PGF2α受体PTGFR(Prostaglandin F Receptor)mRNA和蛋白质表达显著增加,提示PTGFR与月经期子宫内膜的崩解和脱落有关系;分别用PTGFR和PTGER2(Prostaglandin E Receptor 2)抑制剂分别抑制其受体的表达,发现在小鼠月经样模型崩解期P4撤退24h,PGF2α/PTGFR对子宫内膜崩解剥脱更为重要,进一步,本研究发现,PTGFR能够通过血管生成抑制素(angiostatin)导致子宫内膜的崩解脱落;HIF1α作为调控子宫内膜崩解的主要分子,在子宫内膜崩解时与PTGFR具有时空表达一致性。在小鼠月经样模型和细胞系中通过HIF1α抑制剂2ME抑制HIF1α的入核,抑制其发挥转录因子的功能,结合本研究小组既往以及现有工作,HIF1α和PTGFR对子宫内膜崩解脱落起重要作用,发现HIF1α能够调控PTGFR导致子宫内膜的崩解脱落;首次在永生化人子宫内膜基质细胞体外培养细胞中,成功模拟月经子宫内膜的蜕膜化及P4撤退模型,并在细胞模型中验证二者关系;进一步,采用ChIP方法在小鼠月经样模型中初步验证二者之间直接结合的可能性。本研究得到的结果如下:1.在小鼠月经样模型的子宫组织中,PGE2的含量在子宫内膜崩解脱落期增加,特别是子宫内膜崩解期P4撤退12～16 h显著增加,提示PGE2对子宫内膜的崩解起重要作用。PGF2α在月经期P4撤退8h显著增加,在P4撤退后16h达到最大值。这与子宫内膜在发生崩解坏死的关键期相符,其含量的变化与子宫内膜崩解的进程紧密相关,提示PGF2α对子宫内膜的崩解最为重要。在子宫内膜的崩解脱落期,特别是在P4撤退后12～16h,PTGFRmRNA和蛋白质表达显著增加,提示PTGFR与月经期子宫内膜的崩解剥脱有关。2.在小鼠月经样模型中P4撤退后24 h,PTGFR和PTGER2受体抑制剂能明显的抑制子宫内膜的崩解脱落,PTGFR抑制剂的抑制效果比PTGER2更明显。因此,在小鼠月经样模型崩解期,PTGFR对子宫内膜的崩解作用更为重要。同时我们在实验中首次利用永生化人子宫内膜基质细胞,建立体外月经样变化的细胞模型,体外诱导蜕膜化。发现,Ptgfr基因在P4撤退后16 h表达最高,在P4撤退后24 h略有下降。在人子宫内膜基质细胞中进一步验证了二者的调控关系。3.在小鼠月经样模型中,PTGFR抑制剂在P4撤退后8～24 h通过上调其下游血管抑制素蛋白质的表达,抑制血管通透性参与抑制子宫内膜崩解;NF-κB p65 mRNA在8～24 h表达降低,因此PTGFR抑制剂可能通过抑制NF-κB p65 mRNA的表达,参与抑制子宫内膜崩解,但不通过血管内膜生长因子VEGF调控这一过程。4.在小鼠月经样模型中,HIF1α在子宫内膜崩解时与PTGFR具有时空表达一致性,结合本研究小组既往以及现有工作,HIF1α和PTGFR对子宫内膜崩解脱落起重要作用,发现HIF1α能够调控PTGFR导致子宫内膜的崩解脱落。结论:1.在小鼠样月经样模型中PGF2α及其受体PTGFR,PGE2及其受体PTGER2表达均升高,而且PTGFR受体在子宫内膜崩解剥脱的过程中起更重要的作用。2.抑制剂处理后,PTGFR对子宫内膜崩解剥脱的作用,可能通过血管生成抑制素途径,降低血管通透性;可能通过抑制NF-KBp65mRNA的炎症信号通路,抑制调控子宫内膜的崩解剥脱过程。3.PTGFR可能通过上游HIF1α的调控调节子宫内膜崩解剥脱,而且HIF1α与PTGFR可能有直接结合的关系。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R711
【部分图文】：

曲线,样模,月经,小鼠

ｏｎ－ｐｅｃｃｎｎｇ、，ｏａｃｖｙ、逡逑ＢＯ邋（ＭａｘｉｍｕｍＢｉｎｄｉｎｇ）、标准品（Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）和样品孔；逡逑（３）每个孔根据不同试剂盒的要求加入相应的试剂，ＮＳＢ、Ｂｌｋ、Ｂ0和Ｓａｍｐｌｅ／ｓｔｄ逡逑分解加入邋Ｅｌｉｓａ邋Ｂｕｆｆｅｒ。Ｂ0邋和邋Ｓａｍｐｌｅ／ｓｔｄ邋加入邋Ｐｒｉｍａｒｙ邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋后，逡逑室温孵育１邋ｈ，后直接加入Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ，室温孵育２邋ｈ，同时配置逡逑Ｗａｓｈｉｎｇ邋Ｂｕｆｆｅｒ和Ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ邋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ。洗板４次，每次洗板后在纸巾上轻拍。逡逑加入Ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ邋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ室温避光孵育；逡逑（４）最后一步显色完成后３０邋ｍｉｎ内，根据试剂盒所需的波长下测定每孔的ＯＤ逡逑值；逡逑（５）根据每个试剂盒的不同要求拟合标准曲线，根据公式计算得到组织均浆中每逡逑毫克组织标本中含有前列腺素的量；逡逑（６）逦３次重复实验得到的相对表达量，用平均值±ＳＥＭ值作图表示。数据统计分逡逑析用ｔ检验（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ邋ｔ－ｔｅｓｔ）或单因素方差分析（ｏｎｅ－ｗａｙ邋ａｎａｌｙｓｉｓ）检验其逡逑差异性。非正态分布数据用秩和检验（ｒａｎｋｓｕｍｔｅｓｔ）。当户＜０．０５视为差异逡逑显著，户＜０．０１差异极显著；逡逑（７）每个前列腺素检测的ＥＬＩＳＡ标准曲线（见图１－２）：逡逑Ａ邋１２０逦Ｘ—，逦．．．．．．．．—．．．．．．．．．．．邋８邋１００逡逑

熔解曲线,曲线图,非正态分布,秩和检验

４）数据分析（ＡＡＣｔ法）逡逑利用Ｓｔｅｐ－Ｏｎｅ？实时荧光定量ＰＣＲ扩增仪后，得到各个样品所扩增基因的Ｃｔ逡逑值，扩增曲线和熔解曲线（见图１－３）。逡逑Ａ逦Ｍｅｌｔ邋Ｃｕｒｖｅ逦Ｂ逦Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｐｌｏｔ逡逑１００邋？逡逑－一逡逑－逦Ｉ邋＇逡逑ｉ＝邋ｒ；邋Ａｊｆ逡逑—逦ｊ邋；逦ｏｗ，逦／邋／－ｙ逡逑…。逦ｈ丨丨逦＿邋ｆ逡逑Ｉ邋Ｉ逡逑二一邋，／逦０邋００００１逡逑ｉｏｏｏｏｏ逡逑，逡逑、邋00000０１邋－邋逦邋—－—邋－邋－逡逑＾逦Ｘ．逦邋２逦？逦？逦？邋Ｎｎｕ？ｉ＜？ｓａ？ａａｉ＞ｘｉＭａＢａ逡逑ｍｏ逦ｒｏｏ逦ｒｓｏ逦＾邋■0邋ｏ逦ｍｂ逦■00逦ｍｏ逦Ｃｙｔｌｄ逡逑■二滝Ｂ邋灥Ｃ？ＢＤ邋画邋ＥＨＩＦ逦■＊邋１邋Ｂ邋？Ｃ邋■０逡逑｜逦＿Ｅ邋＿Ｐ逦逡逑图１－３．实时荧光定量ＰＣＲ扩增曲线图（Ａ），实时ＰＣＲ熔解曲线（Ｂ）。逡逑根据扩增曲线得到目的基因的Ｃｔ值，代入公式：逡逑／＼Ｃｔ＝Ｃｔ目的基因－Ｃｔ内参基因逡逑ＡＡＣｔ＝ＡＣｔ实验组－ＡＣｔ实验对照组逡逑实验对照组为实验处理的对照组，如孕酮撤退前的Ｏｈ。逡逑ｍＲＮＡ邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋＝邋２￣ＡＡＣｔ逡逑三次重复实验得到的某个基因的相对表达量，用平均值±ＳＥＭ值作图表示。数逡逑据统计分析用ｔ检验（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ邋ｔ－ｔｅｓｔ）或单因素方差分析（ｏｎｅ－ｗａｙ邋ａｎａｌｙｓｉｓ）检验逡逑其差异性。经检验非正态分布数据用秩和检验（ｒａｎｋ邋ｓｕｍ邋ｔｅｓｔ）。当Ｐ＜０．０５视为差异逡逑显者

样模,台盼蓝染色,蛋白,月经

京协和医学院中国医学科学院逦博士研究生学位论文逡逑ｂ．细胞核蛋白提取逡逑将提取过细胞质蛋白的沉淀，加入５００邋ｍＬ预冷的１ＸＰＢＳ，邋１２０００邋ｇ离心２邋ｍｉｎ。逡逑轻吸走液体，弃上清。每个样本加入３００邋｜ｉＬ预冷的细胞核提取液，置于振荡器上逡逑分震荡１５邋ｓｅｃ，后冰上放置２邋ｍｉｎ。重复４次。后在冰上静止１０邋ｍｉｎ。分别取２邋ｐＬ的逡逑胞质蛋白液体和２邋ｐＬ邋２％台盼蓝染液，充分混匀，静止２邋ｍｉｎ后。滴在载玻片上，逡逑并盖上２４Ｘ２４邋ｍｍ的盖玻片，在２０邋Ｘ普通光学显微镜下镜检。观察细胞核膜是否破逡逑，细胞核蛋白完全释放出来。１２０００邋ｇ离心６邋ｍｉｎ，轻轻吸出上清即为细胞核蛋白逡逑（见图１－４）。离心后的上清液迅速转移至预冷的新离心管中，液氮速冻，－８０°Ｃ冰逡逑保存。逡逑＾胞质蛋白逦逦胞核蛋白逡逑

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