MiR-9在子宫颈癌发生发展及放疗耐受中的作用机制研究

发布时间：2020-09-25 19:39

　　子宫颈癌是目前女性最常见的妇科恶性肿瘤之一,根据世界卫生组织WHO 2018年发布的全球癌症统计报告推算,2018年全球女性子宫颈癌新发病例数为569847人,死亡病例数为31 1365人,发病比例13.1%和死亡比例6.9%,在女性肿瘤中均排在第四位,发展中国家发病率及死亡率均显著高于发达国家。2015年中国人口癌症统计学报告中发现,中国女性人群的子宫颈癌发病率以及死亡率从2000年至2014年呈现逐年上升的趋势。高危型人乳头瘤病毒HPV持续性感染是目前公认的宫颈癌发生发展的主要危险因素,但这个过程缓慢,常持续数十年,且仅有极少数的HPV感染患者进展为宫颈癌,说明除HPV持续感染外,多个其它因素参与了致癌过程。因此,深入探究宫颈癌致癌机制,对宫颈癌的精准筛查及治疗具有重要的意义。microRNA(miRNA)是近年来发现的一类来源于内源性染色体上的非编码RNA,平均长度约为22个核苷酸。通过与基因mRNA的非翻译区(3'-UTR)序列互补,引起目的RNA降解或者翻译抑制,从而对基因进行转录后的表达调控。根据其所调控的靶基因的功能不同,miRNA可扮演原癌基因或抑癌基因角色,在恶性肿瘤发生发展、转移及耐药等过程中发挥重要作用。血管生成(angiogenesis)是指在原有的血管上形成新生的血管,正常情况下血管生成是受促血管生成因子和血管抑制因子的协同调控。然而肿瘤形成的过程中血管生成失去了正常的调控,血管生成异常增多。肿瘤血管生长的过程包括血管内皮基质降解、内皮细胞迁移、细胞增殖、内皮细胞形成新的基底膜等步骤。新生血管为肿瘤细胞提供源源不断的营养物质,促进肿瘤迅速生长与转移,是恶性肿瘤侵袭转移及耐药的重要机制。miR-9在胶质瘤、头颈部鳞癌、乳腺癌中表达上调,而在大肠癌、结肠癌、胃癌等中则表达下调,恶性乳腺癌患者的初期,其miR-9水平升高,可促进肿瘤细胞的上皮-间质转化(EMT),并且miR-9可增强血管的生长,从而增加肿瘤的血液供应,促进肿瘤的生长与侵袭。因此本课题主要致力于研究miR-9在子宫颈癌发生发展、血管形成及放疗耐受中作用机制,研究内容主要分为三个部分:第一部分:miR-9-5p在宫颈鳞癌中的表达及其临床意义第二部分:miR-9-5p对宫颈癌细胞增殖转移的影响及其作用机制第三部分:miR-9-5p对宫颈癌放疗敏感性的影响及作用机制第一部分:miR-9-5p在宫颈鳞癌中的表达及其临床意义研究目的:miRNA已被发现在不同类型的癌症中作为癌基因或抑癌基因发挥重要甚至决定性作用。淋巴结转移作为宫颈癌的主要转移途径,其机制有待深入研究。本研究主要目的是筛选与宫颈癌淋巴结转移相关的特异性miRNA,并明确其与临床病理和预后的关系。材料和方法:使用肿瘤基因组图谱计划(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析miRNA在宫颈癌淋巴结转移阳性与淋巴结转移阴性组织中的表达差异。进一步验证miR-9-5p在22例宫颈癌淋巴结转移阳性和22例宫颈癌淋巴结转移阴性患者癌组织中的表达情况,分析miR-9-5p表达差异与宫颈癌患者临床病理特征之间的关系。研究结果:TCGA数据分析显示miR-9-5p在宫颈癌淋巴结转移阳性患者中的表达明显高于淋巴结转移阴性的患者。qRT-PCR(quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)结果表明miR-9-5p在宫颈癌淋巴结转移阳性的患者中mRNA水平表达明显高于未转移患者。TCGA数据库中患者生存分析提示,miR-9-5p表达增高患者与表达相对低患者其总生存期未见明显改变。在22例宫颈癌淋巴结转移阳性患者中miR-9-5p的表达明显高于淋巴结未转移患者,分析44例宫颈癌患者的临床病理资料发现,miR-9-5p在mRNA水平表达的差异仅与淋巴结转移相关,在宫颈癌患者的年龄、分期、分化、肿瘤大小和有无脉管浸润的表达上均无明显差异。研究结论:MiR-9-5p在宫颈癌淋巴结转移阳性患者癌组织中的表达高于未发生淋巴结转移的患者。第二部分:miR-9-5p对宫颈癌细胞增殖转移的影响及其作用机制研究目的:以往研究表明,miR-9在胶质瘤、头颈部鳞癌、乳腺癌中表达升高,扮演癌基因的角色;在恶性乳腺癌患者的初期,其miR-9水平升高,可促进肿瘤细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促进肿瘤的生长与侵袭,根据第一部分的结果,我们推测miR-9-5p在宫颈癌中也是一个癌基因,此部分研究的目的是观察miR-9-5p对宫颈癌细胞增殖侵袭迁移能力的影响,对 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)细胞血管形成能力的影响,同时鉴定miR-9-5p下游靶基因并探索其可能的作用机制。材料和方法:选取宫颈癌细胞系SiHa,通过转染miR-9-5p的mimics或inhibitor来上调或下调miR-9-5p的表达,体外利用CCK-8法测定生长曲线,检测细胞增殖能力;利用Transwell小室实验计数穿过的细胞数目检测细胞侵袭和迁移能力的改变。利用血管形成实验检测miR-9-5p对HUVEC细胞血管形成能力的影响。利用Western blot(WB)检测miR-9-5p对宫颈癌增殖相关蛋白、血管形成相关蛋白及上皮间质转化EMT相关分子的影响。体内实验采用裸鼠皮下成瘤的方法,比较成瘤能力的差异。通过预测软件Targetscan和miRanda筛选出miR-9-5p 下游靶基因SOCS5。免疫组化检测宫颈癌组织和正常宫颈组织中SOCS5表达差异,比较其与miR-9-5p表达的相关性。双荧光素酶报告基因实验验证SOCS5是否可以作为miR-9-5p的直接下游靶点。采用Rescue实验检测SOCS5的过表达是否可以逆转miR-9-5p对宫颈癌细胞的促进作用。Western blot检测上皮间质转化相关分子及血管形成相关分子的变化以确认miR-9-5p与SOCS5的相互作用对下游通路和细胞恶性行为的影响。研究结果:在体外实验中,与对照组相比,转染miR-9-5p mimics组的宫颈癌细胞SiHa的增殖能力增强,其侵袭和迁移能力也明显增强,转染miR-9-5p inhibitor组的SiHa细胞增殖能力减弱,侵袭和迁移能力减弱。以转染miR-9-5p mimics组的细胞上清与HUVEC细胞共培养,HUVEC细胞形成的血管数量比对照组增加,血管结构更加成熟。Western blot实验结果显示转染miR-9-5p mimics组中,EMT相关分子中上皮性标记物E-cadherin的表达明显降低,间皮性标记物N-cadherin、Snail、Vimentin 表达均升高,增殖相关蛋白 p-mTOR(phosphorylated-mammalian target of rapamycin)的表达升高,血管生成相关因子p-VEGFR2和VEGFA 均升高。在转染 miR-9-5p inhibitor 组中,E-cadherin、N-cadherin 等 EMT相关分子、增殖和血管生成相关分子的变化趋势与mimics组相反。在体内实验中,miR-9-5p过表达组裸鼠成瘤能力增加。TargetScan 和 miRanda 的预测结果显示miR-9-5p 存在与 SOCS5 mRNA 3-UTR(un-translationla region)的结合位点。与正常宫颈组织相比,在宫颈癌组织中SOCS5的表达低,与miR-9-5p的表达呈负相关。双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-9-5p mimics显著降低野生型组(wild type,wt)细胞的荧光强度,而没有改变突变组(mutant type,mut)细胞的荧光强度。Rescue实验结果显示,miR-9-5p上调细胞稳定转染SOCS5后,通过血管形成实验分析表明,SOCS5过表达组能够抑制miR-9-5p促进血管生成的作用。Western blot显示在miR-9-5p稳定转染细胞中转染SOCS5后,会逆转miR-9-5p对EMT及血管生成相关因子的调节作用,E-cadherin的表达量上升,血管形成相关分子p-VEGFR2、VEGFA表达显著减少,相关通路p-ERK表达量也相对减少。研究结论:MiR-9-5p通过靶向抑制SOCS5的表达促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进HUVECs细胞的血管形成能力。第三部分:miR-9-5p对宫颈癌放疗敏感性的影响及作用机制研究目的:放疗是宫颈癌治疗的最有效手段之一,miRNA在放疗耐受及敏感中起重要作用。本研究目的在于探究miR-9-5p对宫颈癌放疗敏感性的影响,进一步探索其相关的分子机制,为改善宫颈癌放疗效果提供新思路和靶点。材料和方法:采用OGy、4Gy的γ射线照射转染miR-9-5p mimics的SiHa细胞,将其培养基上清与HUVECs细胞共培养,分析HUVECs细胞的血管形成能力的改变。转染了 miR-9-5p mimics的SiHa细胞转染GFP-LC3慢病毒,在OGy和4Gy的γ射线照射下观察自噬小体的数量,Western blot检测放疗后各组细胞血管形成相关蛋白及自噬相关蛋白的表达量改变。研究结果:在接受4Gy剂量γ射线的照射后,观察到miR-9-5p mimics显著抑制放射线对宫颈癌细胞的杀伤作用。放疗后,NC组和mimics组SiHa细胞培养基与HUVECs细胞共培养后,其血管生成数量都明显减少,转染miR-9-5p mimics组的细胞血管生成数量下降幅度比NC组小。放疗前转染miR-9-5p mimics组的SiHa细胞自噬小体数量比NC组少,放疗后,两组细胞的自噬小体数量均有所增加,mimics组的SiHa细胞自噬小体数量增加幅度比NC组小。Western blot检测发现放疗后自噬相关蛋白LC3表达量增高,p62、p-ULK表达量降低,血管形成相关蛋白p-VEGFR2、p-ERK、VEGFA表达量降低,但mimcs组细胞的表达量比NC组变化幅度明显减少。研究结论:MiR-9-5p通过增加血管形成及减少自噬发生引起宫颈癌细胞的放疗抵抗。本研究创新性:1.首次通过分析TCGA数据库,阐明miR-9-5p在淋巴结转移阳性子宫颈癌中特异性高表达。2.完整的体内体外实验证实miR-9-5p在子宫颈癌发生发展及血管形成中起重要作用。3.首次发现SOCS5是miR-9-5p的直接下游靶点。4.首次阐明miR-9-5p可通过降低自噬的发生影响子宫颈癌的放疗敏感性。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

序列,非编码,内源性,单链

邋＾邋ｂｙ邋ｐｅｒｍｉｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．逡逑图１逡逑微小ＲＮＡ邋（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）是长度为２０－２２个核苷酸大小的内源性的逡逑短非编码单链ＲＮＡ，在ｍＲＮＡ的３＇端非编码（３‘－ＵＴＲ）序列区存在其靶向结逡逑合位点，它可以通过与靶位点的特异性互补结合［８］，降解ｍＲＮＡ或抑制ｍＲＮＡ逡逑翻译达到调节基因表达，从而发挥生物学功能的作用。近来的研宄表明，ｍｉＲＮＡ逡逑的异常表达在肿瘤细胞的增殖、迁移及恶性进展中发挥着关键性作用，ｍｉＲＮＡ逡逑作为癌症预测、诊断和预后的生物标志物的重要作用也得到了广泛的关注［９］。逡逑此外，越来越多研宄表明，ｍｉＲＮＡ在放疗抵抗中也起着重要的作用，如Ｗａｎｇ［１０］逡逑等人发现ｍｉＲ－１０６ｂ的表达在放疗敏感组的肿瘤组织中较放疗抵抗组显著降低。逡逑本研究的目的在于筛选与子宫颈癌淋巴结转移相关的特异性ｍｉＲＮＡ，并探逡逑宄其在子宫颈癌发生发展中的重要作用及对子宫颈癌放疗敏感性的影响，为改善逡逑子宫颈癌放疗效果、提高预后提供新思路和靶点。逡逑２０逡逑

盆腔淋巴结,热图,宫颈癌,差异表达

图１ＴＣＧＡ数据库中宫颈癌患者ｍｉＲＮＡ的表达情况逡逑１Ａ热图显示盆腔淋巴结阳性和阴性的宫颈癌中差异表达ｍｉＲＮＡ，红色代表上调，逡逑绿色代表下调。逡逑１Ｂ邋ＴＣＧＡ数据库中盆腔淋巴结阳性（ｎ＝５２）和盆腔淋巴结阴性（ｎ＝１０７）的宫颈逡逑癌患者组织中ｔｎｉＲ－９－５ｐ的相对表达量。＊＊ｐ＜０．邋０１逡逑５５逡逑

盆腔淋巴结,阴性,宫颈癌

图２我院盆腔淋巴结阳性（ｎ＝２２）和盆腔淋巴结阴性（ｎ＝２２）的宫颈癌患者逡逑ｍｉＲ－９－５ｐ邋的相对表达量

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