褪黑素在人颗粒细胞调控StAR生成的机制研究

发布时间：2020-10-01 18:40

　　性激素属于类固醇甾体类激素,主要包括雌激素、雄激素和孕激素,成年女性体内性激素的分泌呈现周期性变化。性激素的生成过程包括一系列复杂的酶促反应。在反应的第一个酶促步骤中,类胆固醇作为合成类固醇甾体类激素的原料之所以能够实现从线粒体外膜至线粒体内膜的转运,主要是受到了类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory,StAR)的作用。这是甾体类激素生成的重要步骤,也是限速步骤。因此StAR被称为类固醇激素生成的限速酶。在此限速步骤之后,受到胆固醇侧链裂解酶(The cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)的作用,进入线粒体内的胆固醇则会转变为孕激素、雄激素和雌激素等性激素合成的前体物质——孕烯醇酮。褪黑素(N-乙酰-5-甲氧色胺,Melatonin)是由松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,参与很多重要的生理功能,并且能够调控与昼夜节律和生殖相关的多种中枢和外周活动。植物与动物中均存在褪黑素受体(Melatonin receptor,MT),在哺乳动物中已被克隆的褪黑素膜表面受体为MT1(又称Mel 1a)和MT2(又称Mel 1b),均为具有7个跨膜段的G蛋白耦联受体。褪黑素通过MT介导cAMP(cyclic adenosine monophosphate)、IP3及cGMP(cyclic guanosine monophosphate)信号转导通路参与相应的生理病理过程。生殖系统中褪黑素受体存在于子宫、卵巢和乳腺上皮细胞、黄素化的颗粒细胞。褪黑素具有抗氧化和抗凋亡的作用,在人卵泡液中高表达,能够刺激卵母细胞成熟促进因子的启动和胚泡的破裂。此外,它还参与下丘脑-垂体-性腺轴功能和生殖内分泌活动的调节。大量研究表明褪黑素对生殖系统的作用因物种种类、生理状态不同而表现出抑制、促进或无作用的多重性。生殖系统中已知的参与调控StAR表达的主要信号通路为cAMP-PKA(Cyclic adenosine monophosphate/Protein kinase A)信号通路。除此之外,也有很多其他的激素、生长因子或细胞因子可以通过激活不同的胞内信号通路参与调控StAR的表达。其中在颗粒细胞中LH/hCG(Luteinizing hormone/Human chorionic gonadotrophin)可以调控StAR的表达。表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)相关家族因子及受体在生殖系统广泛分布,与多种生殖过程相关。其中体内及体外实验均已经证实,AREG(Amphiregulin)作为LH/hCG峰后卵泡液内表达量最多的EGF家族成员,具有LH样作用,即促进卵母细胞成熟、促进卵丘复合体(Cumulus oocyte complex,COC)扩张、通过调控环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的表达调控排卵的发生。已有的研究也证实了AREG同样在StAR的生成过程中起着重要的作用。其中,在人颗粒细胞中,AREG已被证实可以通过与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)结合而活化ERK1/2信号通路上调StAR的表达。褪黑素及其受体在LH/hCG峰后也急速上升,且同样可以促进卵母细胞成熟、促进排卵。此外,褪黑素已被证实参与调控cAMP-PKA信号通路。但其是否影响StAR的表达以及褪黑素与AREG是否具有协调作用来一起参与调控StAR的表达尚不十分清楚。因此,本文旨在研究褪黑素是否参与调控StAR表达以及是否与AREG具有协调作用来一起参与调控StAR的表达,并进一步深入研究其中可能的作用机制。目的:证实在人颗粒细胞中,褪黑素是否参与调控StAR表达生成及其调控机制以及褪黑素是否与AREG具有协调作用可以一起参与调控StAR的表达及其中可能的作用机制。方法:我们以人原代颗粒细胞为研究模型,探究褪黑素是否参与调控StAR表达生成及其中相关的调控机制。主要通过实时荧光定量PCR(Real time-qPCR,RT-qPCR)和western blotting技术对颗粒细胞中RNA和蛋白的表达水平进行了检测。对卵泡液内褪黑素的浓度以及血清内孕激素的浓度进行了检测,分别应用了酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)的检测方法。结果:在人颗粒细胞中,褪黑素可以增强StAR表达,这种的上调作用具有时间与剂量依赖性且这种上调作用可被其受体抑制剂Luzindole所阻断;褪黑素可通过活化PKA/CREB信号通路调控StAR的表达,且这种调控作用可被PKA抑制剂H89所阻断;褪黑素可增强AREG作用下StAR的表达;褪黑素通过与EGFR结合活化ERK1/2信号通路增强AREG作用下StAR的表达;褪黑素对AREG的这种协同增强作用可被EGFR抑制剂AG1478所阻断;此外,卵泡液内褪黑素的浓度与hCG日、取卵日(Oocyte pick up,OPU)血清内孕激素的浓度存在正相关关系。结论:1.在人颗粒细胞中,褪黑素可通过与其受体MT结合活化PKA/CREB信号通路直接调控StAR的表达;2.在人颗粒细胞中,褪黑素可通过与EGFR结合活化ERK1/2信号通路协同增强AREG作用下的StAR表达;3.卵泡液内褪黑素的浓度与血清内孕激素的浓度呈正相关。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R71
【部分图文】：

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褪黑素,StAR蛋白

图 2：在人颗粒细胞中，褪黑素通过与 MT 结合促进 StAR 蛋白的表达。分别使用 DMSzindole（10nM）来对颗粒细胞进行预处理，约 1h，再给予褪黑素（0.5mmol/L），于集颗粒细胞的蛋白， StAR 的蛋白表达量的变化检测主要通过 western blotting 实验。实验结果的表示为：独立重复实验（至少三次）的结果表示“均数±标准差”，不注字母代表着 p<0.05，表示具有显著统计学差异。3 在人颗粒细胞中褪黑素通过 PKA/CREB 信号通路调控 StAR达为了检测 CREB 信号通路是否参与了褪黑素对 StAR 的调控过程，使mmol/L 的褪黑素分别对颗粒细胞进行 10min、30min、60min 的处理，然后对应的蛋白质，采用 western blotting 的方法探究褪黑素对 CREB 的磷酸化（pCREB）的影响。Western blotting 的结果显示，褪黑素作用 10min 后即著促进 CREB 的磷酸化（附图 3A）。此外，使用 PKA 通路特异抑制剂探黑素调控 StAR 表达的通路(附图 3B)。结果显示，PKA 通路抑制剂 H89 能褪黑素对 StAR 的调控作用。因此，褪黑素通过 PKA/CREB 信号通路参与

褪黑素,StAR蛋白,信号通路,诱导作用

附图 3：在人颗粒细胞中，CREB 信号通路介导褪黑素对 StAR 蛋白的诱导作用。图 A：使用褪黑素（0.5mmol/L）处理颗粒细胞，分别作用 10min、30 min、60 min。使用western-blotting 的方法检测磷酸化 CREB（p-CREB）的蛋白表达水平。洗脱该膜上的一抗，使用 CREB 再次孵育，检测 CREB 蛋白的表达水平。图 B: 预处理颗粒细胞 60min（分别使用 DMSO, H89），再给予 0.5mmol/L 褪黑素刺激颗粒细胞 24h， StAR 蛋白的表达水平的差异通过 western-blotting 实验来检测。“ x ±s”来表示 3 次独立重复实验结果，不同的标注字母代表着 p<0.05，表示具有显著统计学差异。3.4 人颗粒细胞中，褪黑素可增强 AREG 受体 EGFR 的表达将人原代颗粒细胞体外培养，从时间及浓度方面探究褪黑素对 EGFR 表达的作用特点。结果显示，0.05mmol/L 及 0.5mmol/L 的褪黑素作用 24h 后均能明显上调 EGFR 蛋白的表达，并且当褪黑素作用浓度为 0.5mmol/L 时，其对 StAR蛋白的上调作用更为显著（附图 4A）。使用 0.5mmol/L 的褪黑素作用于颗粒细胞，于不同时间点收集蛋白，结果显示当褪黑素作用时间为 24h 时，其对 EGFR蛋白的上调作用更为显著（附图 4B）。

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