Hmgb1在小鼠子宫内膜蜕膜化过程中的功能研究

发布时间：2020-10-02 07:38

　　目的:哺乳动物的妊娠过程涉及到胚胎着床、胎盘形成、胚胎发育和分娩等多个环节,是一个极其精细且复杂的过程。胚胎着床后,位于系膜对侧胚胎周围的子宫内膜基质细胞进行增殖和分化,即蜕膜化(decidualization)。蜕膜细胞在子宫的横切面会形成两个明显的区域:围绕着胚胎的无血管的初级蜕膜区(primary decidualization zone,PDZ)和紧邻初级蜕膜区广泛分布血管的次级蜕膜区(secondary decidualization zone,SDZ)。基质细胞蜕膜化是胚胎着床过程中的关键环节。蜕膜化的机制目前依然尚未研究全面。高迁移率族蛋白B1(high motility group B1,Hmgb1)对于哺乳动物生命的存续是必须的。以往关于Hmgb1在妊娠中的作用研究集中在Hmgb1对囊胚发育的影响,Hmgb1在妊娠早期子宫中的作用及功能暂无研究。本课题组前期的表达谱测序发现Hmgb1在子宫内膜蜕膜化组织中表达上调。因此,本研究首先拟探讨Hmgb1与子宫内膜蜕膜化之间的关系。此外,Hmgb1在线粒体的质量控制(能量代谢系统、线粒体自噬以及线粒体融合/分裂)中发挥着重要的调控作用。而高能量驱动的线粒体活性在多倍体蜕膜细胞发育中发挥重要作用,以支持子宫内膜的分化和胚胎植入。线粒体功能异常导致的蜕膜细胞多倍化受损可能导致不孕。因此,本研究欲探讨的第二个问题,即Hmgb1在蜕膜化过程中是否调控线粒体质量控制。另外,Hmgb1在核内能够促进类固醇激素受体(ER/PR)等转录因子与靶DNA的结合,调控基因转录、表达及细胞分化等生命活动。雌激素受体(ERα和ERβ)和孕激素受体(PR-A和PR-B)在胚胎着床和蜕膜化中担负重要的角色。因此,本研究拟探讨第三个问题:核内Hmgb1是否转录调控ER/PR应答基因而影响蜕膜化过程。被释放到胞外的Hmgb1可与多种受体如RAGE,TLR4,TLR9等相互作用调控免疫过程。蜕膜化过程中会有多种免疫细胞的参与。因此,本文拟探讨的第四个问题:释放到胞外的Hmgb1是否会调控免疫从而影响蜕膜化过程。本文研究了Hmgb1在围着床期的表达规律及其调控小鼠蜕膜化过程的分子机制,以全面了解Hmgb1在围着床期的作用,为蜕膜化的研究提供新的有力证据。方法:1.建立动物孕期模型:小鼠正常妊娠模型:8周龄性成熟昆明雌鼠(体重28-30g)与性成熟雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为孕第一天(D1)。取小鼠妊娠D1,D4,D5,D6,D8子宫内膜组织材料(8只/天)。小鼠假孕模型:8周龄性成熟昆明雌鼠与结扎输精管雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天(PD1)。取小鼠假孕PD1,PD4,PD5,PD6,PD8子宫内膜材料(8只/天)。小鼠延迟着床模型:妊娠D3小鼠晚上被切除双侧卵巢。在妊娠D4-D7早晨给予切除卵巢的小鼠皮下注射孕酮100μl(1mg/0.1ml玉米油)。妊娠D7天将小鼠分为两组:一组继续皮下注射孕酮100μl(1mg/0.1ml玉米油),记为延迟着床组(5只/组)。另一组皮下注射孕酮100μl(1mg/0.1ml玉米油)和雌二醇100μl(25ng/0.1mL玉米油),记为延迟着床激活组(5只/组)。D8脱颈处死小鼠,延迟组用生理盐水冲洗子宫后检测是否有延迟着床的胚胎,激活组尾静脉注射1%台盼蓝溶液,检测是否有着床的胚胎。人工诱导蜕膜化模型:8周龄性成熟昆明雌鼠与结扎输精管雄鼠合笼交配,次日早晨检查阴栓,见阴栓记为假孕第一天(PD1)。PD4清晨小鼠子宫一侧宫角注射玉米油5μl,对侧子宫注射等量PBS作为对照(8只/组)。至PD8早晨取子宫内膜材料。宫角注射:小鼠于假孕第四天(PD4)上午进行宫角注射Hmgb1抑制剂甘草酸,双侧子宫角一侧注射5μl甘草酸(glycyrrhizia acid,GA)+玉米油(Oil)混合液(5mM),对侧宫角注射5μl玉米油(含等量甘草酸溶剂DMSO),于PD8收集子宫内膜材料(5只/组)。另外5只PD4小鼠,一侧宫角注射5μl玉米油(含甘草酸溶剂DMSO),对侧宫角注射等量DMSO,PD8收集子宫材料(5只/组)。另外5只PD4小鼠一侧子宫角注射5μl PBS作为对照,对侧子宫角注射等量DMSO,于PD8收集子宫材料(5只/组)。2.细胞体外诱导蜕膜化模型:原代子宫内膜基质细胞培养液中加入最终浓度为10nM雌二醇(E_2)与1μM孕酮(P_4)诱导72h,对照组加入溶剂无水乙醇作为对照。3.Hmgb1的表达与蜕膜化的关系:(1)子宫内膜蜕膜化检测:观察围着床期小鼠蜕膜化时期(D5-D8)子宫外观。人工诱导蜕膜化后,对子宫称重,RT-qPCR检测蜕膜化标识分子dtprp的mRNA水平,以验证人工诱导蜕膜化是否成功。体外功能实验,诱导蜕膜化利用雌孕激素诱导小鼠原代子宫内膜基质细胞,采用RT-qPCR检测dtprp的mRNA水平。(2)Hmgb1在围着床期的表达:免疫组化(IHC)、原位杂交(ISH)、Western Blot、RT-qPCR检测在D1、D4、D5IS(着床点)、D5IIS(着床旁)、D6IS、D6IIS、D8IS天Hmgb1的表达情况;(3)Hmgb1在假孕期的表达:IHC、Western Blot、RT-qPCR检测在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8天Hmgb1的表达情况;(4)Hmgb1在延迟着床模型的表达:IHC检测在延迟着床组与激活组Hmgb1的表达;(5)Hmgb1在人工诱导蜕膜化模型的表达:IHC、Western Blot、RT-qPCR检测在人工诱导蜕膜化组织(ID)以及对照组织(Vehicle)中Hmgb1的表达情况;(6)Hmgb1在原代子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型中的表达:免疫荧光鉴定原代细胞纯度;RT-qPCR检测dtprp的表达以鉴定诱导蜕膜化是否成功;检测诱导诱导蜕膜化组以及siRNA敲低Hmgb1组dtprp,hmgb1的mRNA水平。4.宫角注射Hmgb1抑制剂甘草酸,检测蜕膜化情况:观察宫角注射后小鼠子宫外观,统计子宫湿重。5.线粒体质量控制检测方法:(1)采用激光共聚焦检测线粒体形态,比较敲低Hmgb1的表达对线粒体形态学影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。Mitotracker Red染色细胞线粒体,通过激光共聚焦观察线粒体碎片化程度。统计各组碎片化程度。(2)采用流式细胞术检测线粒体膜电位,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。JC-1染色细胞,流式细胞仪检测红、绿荧光强度,用红/绿比值评估线粒体膜电位是否发生变化。(3)采用酶标仪检测ATP生成,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响:细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。采用酶标仪检测ATP生成量。(4)采用流式细胞术检测活性氧(ROS)生成状况,评估敲低Hmgb1对线粒体功能的影响。细胞处理组分为5组:Vehicle、si-Nc、si-Hmgb1、si-Nc+E2+P4、si-Hmgb1+E2+P4。DCFH-DA探针染色细胞,流式细胞仪检测活性氧强度。6.细胞自噬的检测:(1)体内诱导蜕膜化模型,Western Blot检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;(2)体外细胞实验,敲低Hmgb1后诱导蜕膜化,Western Blot、RT-qPCR检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;(3)宫角注射甘草酸与玉米油模型,Western Blot、RT-qPCR检测各处理组线粒体相关因子及自噬相关因子的表达;透射电镜检测自噬小体。7.RNA-seq检测在蜕膜化过程中受Hmgb1调控的差异基因采用转录组测序法对宫角注射的正常组(PBS)-A1组、诱导蜕膜化组(Oil+DMSO)-A2组、溶剂对照组(DMSO)-A3组、抑制组(GA+Oil+DMSO)-A4组的子宫组织材料进行转录组测序,分析差异表达基因,对差异基因进行功能聚类(GO分析)。8.RNA-seq测序数据分析:(1)分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与线粒体功能相关的差异基因;(2)分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与ER/PR应答基因相关的差异基因;(3)分析在蜕膜化过程中受Hmgb1调控与免疫相关的差异基因。结果:1.Hmgb1对蜕膜化的影响:(1)Hmgb1在围着床期的表达规律:IHC结果显示:Hmgb1仅表达于D1腔上皮与腺上皮;D4天Hmgb1表达于腔上皮、腺上皮以及部分基质细胞中;Hmgb1高表达于D5IS初级蜕膜区以及D6IS、D8IS的次级蜕膜区,在D5IIS与D6IIS仅表达于腔、腺上皮。ISH结果显示:同IHC结果一致,Hmgb1于D1仅表达于腔上皮与腺上皮,D4表达于腔、腺上皮与部分基质细胞;Hmgb1在D5IS、D6IS、D8IS蜕膜区域高表达,D5IIS与D6IIS仅在腔上皮与腺上皮表达。Western Blot与RT-qPCR结果显示Hmgb1在着床点高表达。(2)Hmgb1在假孕期的表达规律:IHC结果显示:Hmgb1在PD1、PD4、PD5、PD6、PD8腔上皮与腺上皮表达,且PD5、PD6、PD8呈弱表达。Western Blot与RT-qPCR结果显示Hmgb1在PD5、PD6、PD8弱表达。(3)Hmgb1在延迟着床模型的表达规律:IHC结果显示,Hmgb1低表达于延迟组,高表达于激活组。(4)Hmgb1在诱导蜕膜化模型的表达:诱导蜕膜化组经dtprp鉴定为诱导蜕膜化成功模型,Hmgb1在诱导蜕膜化组呈强阳性表达。(5)抑制Hmgb1对体内蜕膜化的影响:宫角注射获取人工诱导蜕膜化组(Oil)、GA+Oil组、PBS组以及溶剂DMSO组,结果显示,与诱导蜕膜化组相比,GA+Oil组蜕膜化受到抑制。(6)敲低Hmgb1对体外诱导蜕膜化的影响:在原代子宫内膜基质细胞中加入siRNA敲低Hmgb1后诱导蜕膜化发现:Hmgb1敲低后蜕膜化标志物dtprp表达下降,表明敲低Hmgb1会阻碍蜕膜化进程;细胞仅诱导蜕膜化后Hmgb1表达升高。2.Hmgb1调控线粒体质量而影响蜕膜化进程:(1)Mitotracker Red染色细胞线粒体,采用激光共聚焦观察线粒体碎片化程度发现,与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组线粒体碎片化程度增高,影响线粒体形态结构;(2)流式检测线粒体膜电位发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组线粒体膜电位降低,影响线粒体发挥正常功能;(3)酶标仪检测ATP生成发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组ATP生成减少,影响线粒体发挥正常功能;(4)流式细胞检测ROS生成发现:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组活性氧释放增多,影响线粒体发挥正常功能。4.Hmgb1调控细胞自噬过程进行线粒体质量控制,从而影响蜕膜化进程:(1)体内诱导蜕膜化模型,采用Western Blot检测发现,诱导组线粒体相关因子Drp1、Slp2表达上调,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达上调;(2)体外细胞实验:与诱导组相比,敲低Hmgb1后诱导组,Western Blot检测线粒体相关因子Slp2表达降低,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达降低;RT-qPCR检测线粒体相关因子slp2,dnm1l降低,自噬相关因子map1lc3b,atg5表达下降,sqstm1表达升高;(3)宫角注射玉米油人工诱导蜕膜化组(Oil)、注射GA+Oil组、注射PBS组以及注射溶剂DMSO组:Western Blot检测线粒体相关因子Slp2,GA+Oil组较诱导组(Oil)蛋白水平表达下降,自噬相关因子Lc3b-Ⅱ表达下降,p62表达升高;RT-qPCR检测线粒体相关因子slp2表达降低,自噬相关因子map1lc3b,atg5表达下降,sqstm1表达升高。(4)在诱导组(Oil)可观察到自噬小体,GA+Oil组可看到空泡化线粒体存在。5.对玉米油宫角注射人工诱导蜕膜化Oil(A2)、GA+Oil(A4)、注射PBS(A1)以及注射溶剂DMSO(A3)的子宫组织进行RNA-seq测序,结果共获得在蜕膜化过程中与Hmgb1相关的差异基因1505个,其中与线粒体功能和自噬相关的差异基因有32个;与转录调控ER/PR应答基因的差异基因有27个;与调控免疫相关的差异基因有19个。结论:1.Hmgb1在围着床期具有特定的时空表达特点,在胚胎着床过程中与蜕膜化相关;缺乏Hmgb1会抑制小鼠子宫内膜基质细胞的蜕膜化进程,从而影响妊娠结局。2.在蜕膜化过程中,Hmgb1通过调控胞质中线粒体自噬而进行线粒体质量控制;缺失Hmgb1则无法正常调控细胞自噬而造成线粒体损伤,线粒体无法发挥正常功能最终造成蜕膜化进程受阻。3.在蜕膜化过程中,核内Hmgb1通过调控ER/PR应答和免疫应答过程相关基因从而发挥调控细胞增殖与分化功能。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R71
【部分图文】：

围着床期,蜕膜化,免疫组化检测,棕色

重庆医科大学博士研究生学位论文采用酶解法分离小鼠原代子宫内膜基质细胞，细胞纯度为 99%（图 9A）。进一步利用 siRNA 敲低 Hmgb1 的表达（图 9B 和 9C）。在此基础上，对敲低组细胞和对照组细胞进行体外诱导蜕膜化，结果显示，Hmgb1 高表达于诱导蜕膜化组（si-Nc+E2+P4）（图 9D）,蜕膜化标志物 dtprp 在敲低诱导组（si-Hmgb1+E2+P4）中低表达。说明敲低 Hmgb1 蜕膜化过程受到阻碍（图 9E）。通过此细胞功能实验可知：Hmgb1 的表达会影响子宫内膜基质细胞蜕膜化进程，敲低 Hmgb1,蜕膜化进程将不能正常进行。

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重庆医科大学博士研究生学位论文plantation sites; LE, luminal epithelial; GE, glandular epithelium; em, embryidual zone; S, stroma; SDZ, secondary decidual zone; em, embryo. NC, negPC, positive control; Scale bar, 200 μm

柱状图,围着床期,棕色,小鼠

重庆医科大学博士研究生学位论文误表示。柱状图每条柱上不同的小写字母表示组间有统计学差异（P < 0.05），相同字母表示组间无统计学差异。每组实验重复 3-4 次。Fig.2 Western blot analysis of Hmgb1 protein expression (A and B)and real-time quantitativepolymerase chain reaction examination of endometrial Hmgb1 mRNA expression (C).Actb was used as an internal control. One-way analysis of variance was used to calculate thedifferences. The results are represented as mean ±SE. Bars labelled with different lowercase lettersindicate that the data are significantly different between groups (P < 0.05).

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