Rab12对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及作用机制的初步研究

发布时间：2020-10-22 04:05

　　 研究背景宫颈癌是女性生殖系统十分常见的恶性肿瘤,其主要病因是高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染,HPV编码的癌蛋白E6/E7是导致宫颈细胞恶性转化的关键蛋白。放射治疗是中晚期宫颈癌的重要治疗方法,放疗后复发仍然是宫颈癌患者治疗中的主要问题,研究其分子机制是解决肿瘤细胞放射耐受的关键。有研究表明HPV阳性的细胞系SiHa、HeLa比HPV阴性细胞系C33A对放射更耐受,研究HPV在宫颈癌放疗中的作用能为更好的治疗宫颈癌提供新思路和靶标。小GTP酶蛋白Rab属于Ras蛋白超家族的一员,很多癌症中存在Rab的异常表达。Rab12与分布在胞质中的小囊泡相关联,它可能加速囊泡从细胞边缘到核周中心体区域转运,也可以通过控制循环内体到溶酶体的载体运输这一途径,间接地刺激自噬。DENND3是Rab12的上游分子,RILP-L1、RILP是Rab12的效应分子。放射可诱导细胞发生自噬,自噬可能作为细胞保护机制,通过清除异常蛋白质和缺陷细胞器保持营养和能量的体内平衡。我们前期实验发现HPV编码的早期癌蛋白E6与E7可上调Rab12的表达,Rab12是否对HPV阳性宫颈癌细胞放射耐受起作用有待研究。研究目的研究Rab12对宫颈癌放射敏感性的影响及其机制。研究方法与结果1.HPV早期癌蛋白E6/E7影响Rab12的表达利用逆转录病毒包装系统获得含质粒pBabe-Vector、HPV16E6和HPV16E7的病毒颗粒,感染细胞并用嘌呤霉素筛选获得稳定表达E6/E7的细胞系,Western blot检测发现E6/E7可上调Rab12的表达。在宫颈癌SiHa、Caski细胞(HPV16阳性的宫颈癌细胞)中干扰16E6/E7,在HeLa细胞(HPV18阳性的宫颈癌细胞)中干扰18E6/E7,Western blot检测发现干扰E6/E7后Rab12的表达降低。2.射线对细胞中Rab12表达的影响Western blot 检测不同细胞系 SiHa、HeLa、C33A、HaCaT 放射前后 Rab12的表达量。进一步检测SiHa细胞放射后不同时间,以及不同放射剂量梯度下Rab12的表达。发现放射可促进Rabl2表达。3.Rab12与宫颈癌放疗敏感性的研究SiHa细胞分为NC组与干扰Rab12组,C33A细胞(HPV阴性的宫颈癌细胞)分为NC组与过表达Rab12组,分别照射不同剂量梯度的的X射线,通过克隆形成实验、绘制生存率曲线、CCK-8实验检测射线对不同处理组细胞生长增殖情况和活力的影响。在SiHa细胞干扰Rab12组,细胞增殖更慢,活力更低;在C33A细胞过表达Rab12组,细胞增殖更快,活力更高。这表明Rab12促进了宫颈癌细胞的放射抵抗。4.放射条件下宫颈癌细胞中Rab12与细胞凋亡的研究Western Blot检测放射组与化疗组处理后凋亡相关的蛋白PARP1、Cleaved-PARP1与Bcl-2的表达变化,结果显示放射后24h,SiHa细胞凋亡没有明显变化。而顺铂处理后24h可看到Bcl-2随药物剂量的增加而明显减少,PARP1也被剪切成Cleaved-PARP1。SiHa细胞在化疗药物顺铂诱导下的细胞凋亡可能是其主要死亡形式,而SiHa细胞对放疗的反应中,细胞凋亡途径起到的作用相对较小,Rab12影响宫颈癌放疗敏感性并不是通过影响相关的细胞凋亡途径。5.Rab12对宫颈癌细胞自噬的影响干扰Rab12与无血清饥饿诱导自噬,Western Blot检测自噬相关指标p62、Beclin1、LC3B,结果表明人宫颈癌细胞中Rab12与细胞自噬有关。SiHa细胞分为NC组与干扰Rab12组,Western Blot检测不同梯度剂量照射下以及照射后不同梯度时间下的自噬相关指标p62、Beclin1、LC3B,结果表明干扰Rab12可逆转放射引起的自噬升高。6.Rab12对宫颈癌细胞放射后细胞周期的影响流式细胞术检测放射、顺铂、博来霉素处理24h后SiHa细胞干扰Rab12组与NC组细胞周期变化,检测放射后C33A细胞Rab12组与NC组。干扰Rab12和过表达Rab12不改变正常生长状态下细胞的细胞周期,但是可以影响放射或药物损伤后细胞周期的分布。结论本研究首次证实了 HPV早期癌蛋白E6、E7可上调Rab12的表达,过表达Rab12后的宫颈癌细胞生长增殖加快,提示Rab12可能与肿瘤的恶性程度相关。Rab12参与调节HPV阳性宫颈癌细胞的放射耐受,其作用主要是通过促进细胞保护性自噬,调控细胞周期来实现的。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

?附图??图１??Ａ?Ｂ??＾?＾?■?ＩＪＭＳＣＣ?ＩＤＡ－Ｖｅｃｔｏｒ??＞ｂ?ｍ?ＵＭＳＣＣ１０Ａ－１６ＩＩ７??划?１－５１??＿?１－０－??—４ｍｍｔ＾?Ｅ２Ｆ１?ｉ－?＾?＼??味。．５－?■?＿?????一＊?雲?Ｓ?＇■??ｗｍｍ?ｍｔｍｍ?ＧＡＰＤＨ?蒼?〇■〇—＾＿??图１?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测构建的细胞系中蛋白表达变化。??Ａ：?Ｅ２Ｆ１、ｐ５３蛋白的表达；Ｂ：三次实验采用ＧＡＰＤＨ标准化处理后的Ｅ２Ｆ１和??ｐ５３?蛋白表达。＊＊＊Ｐ＜０．００１。??４６??

??图２??Ａ?，?Ａ?Ｂ?Ｃ??Ｋ＃、＃、?ＸＮ＾?＾?＾?＾?’??夕?夕?Ｋ？ｂｉ２?４ｍｍ?ｍｍ?ｍｍ??Ｒａｂ１２?ｍｍ？ｍ?孀■＿■？?Ｒａｂ！２?嫌－．＂ｍｍｍｍ??ｐ５３?＾ｖＮＵｐｉＰ１?：獅??ＧＡＰＤＩｉ?—？晒＿?ＧＡＰＤＨ?ｍｒｎｍｍ?ｍｍｍ?ＧＡＰＤＨ?ｍｍｍｍ?ｍｍｔｍ??１．Ｓ－｜??１３－ｊ?１．０＞ｉ??［＿?ｉ：：＿?．?ｌ＿?．?＿??■■?ａ?■??ｏｏＬＭｍｍ＿＿ｏｏＬａｉｐｉ——??Ｔ．－＾???，、?Ｚ?＾?，?，?Ｉ??图２?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测构建的稳转细胞系中Ｅ６、Ｅ７癌蛋白对Ｒａｂｌ２表达的影响??Ａ：稳转Ｅ７的ＵＭＳＣＣ?１０Ａ细胞系中Ｒａｂｌ２表达增多，＊＊Ｐ＜０．０１；?Ｂ：稳转Ｅ７的??ＨａＣａＴ细胞系中Ｒａｂｌ２表达增多，＊Ｐ＜０．０５；?Ｃ：稳转Ｅ６、Ｅ７的ＲＰＥ１细胞系中??Ｒａｂｌ２?表达均增多，＊Ｐ＜０．０５，?＊＊户＜０．０１。??４７??

??图３??Ａ?＂Ｂ?＂?Ｚ?ｃ，，Ｖ’??ＲａＭ２?ｍｍ?ｍｍｒｎ?Ｒｕｂ?１２?ｍｍ?ｍｍｍ?Ｒａｂ！２?：竭編＿?難離??ｐ５３?ｍｍｍ?■丨＿＂＿?ｐ５３?ｍｔｍ?４Ｈ｜?ｔｆＨｋ?ｐ＞３?ｍｍｍ?ｍ／ｔｍ?丨，＿??Ｅ２ＦＩ?物轉Ｅ２ＦＩ?ｍｍｍ?ｍｍ?ｒｎｍｍ?Ｅ２Ｆ１?ｍ?ｍ??ＧＡＰＤＨ?４ＨＭＰ?ＧＡＰＤＨ?ｍｍｍ?ｍｔｍ?ｑａｐｄｈ?ｍｍ?ｍｍｍ??Ｓｉ?Ｈａ?Ｃａｓｋｉ?ＨｅＬａ??１，０＊ｊ?Ｕ－ｊ?１３－｜??ｚｉ?〇．６－?口１。’?－?１〇?ｍＳｍ??：Ｄａ：ｌ＾：４．３：ｌ?：！．Ｃ??／?／＇／?＃?／?ｚ＼／??ＳｉＨａ?Ｃａｓｋｉ?ｌｉｃｌａ??图３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测宫颈癌细胞系中千扰Ｅ６、Ｅ７后对Ｒａｂｌ２表达的影响??Ａ：在ＳｉＨａ细胞系中干扰１６Ｅ６／Ｅ７，?Ｒａｂｌ２表达减少，＊＊尸＜０．０１，＊＊＊尸＜０．００１；??Ｂ：在?Ｃａｓｋｉ?细胞系中干扰?１６Ｅ６／Ｅ７，?Ｒａｂｌ２?表达减少，＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１；??Ｃ：在ＨｅＬａ细胞系中干扰１８Ｅ６Ｅ７，Ｒａｂｌ２表达减少，＊尸＜０．０５。??４８??
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 史娟;贾蕾;樊霞;;下调整合素连接激酶对宫颈癌细胞糖酵解及增殖、凋亡的影响[J];第三军医大学学报;年期

2 常凯凯;杨慧丽;周文洁;李明清;谢锋;;缺氧通过刺激胸腺基质淋巴细胞生成素分泌促进宫颈癌细胞体外侵袭[J];中国临床医学;2017年02期

3 李贞彩;姜平;王秋宇;杨丽;符鹏晓;张金茹;;血根碱对宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力影响机制研究[J];重庆医学;2017年22期

4 陈观娣;范格英;游可理;钱德英;岑坚敏;舒焰红;李志刚;;5-氮杂-2'-脱氧胞苷对宫颈癌细胞的基因表达调控[J];实用医学杂志;2016年18期

5 白桦;李祥;聂晶;韩卫东;孟元光;;低剂量地西他滨增强T细胞对宫颈癌细胞杀伤活性研究[J];解放军医学院学报;2015年05期

6 李娟;多重PCR分析宫颈癌细胞中16型HPV的状态[J];国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册);2004年03期

7 苏喆;洪阁;;微小RNA-103a对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响[J];山西医科大学学报;2018年06期

8 贺帅;吴彦萍;蔡湘仪;陈红波;王丽君;黄来强;;姜黄素对宫颈癌细胞生长与增殖的影响研究[J];现代生物医学进展;2017年01期

9 李晶;魏枫;杨帆;郑禹;赵华;任秀宝;;宫颈癌细胞高迁移率族警报素的分泌与肿瘤浸润淋巴细胞的相关性[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2017年03期

10 孙泽雨;陈颖;林家香;刘娟;赵蔚明;;磷脂酰肌醇-4-磷酸酶Ⅱ型对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响[J];山东大学学报(医学版);2017年11期

相关博士学位论文 前10条

1 李波;卵巢癌和宫颈癌细胞对二氯乙酸盐的抵抗机制及增敏措施研究[D];第三军医大学;2017年

2 刘佳妹;CircRNA8924竞争性抑制miR-518d/519-5p家族调控CBX8影响宫颈癌细胞生物学行为的机制研究[D];中国医科大学;2018年

3 王路芳;β-榄香烯通过介导β-catenin/TCF7/Sox2信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间质变的转化[D];中国医科大学;2018年

4 漆云翔;宫颈癌细胞EGFR核转位介导的放射抵抗的潜在机制及临床研究[D];广西医科大学;2017年

5 王红英;Connexin26、43对宫颈癌细胞的抑制作用及其信号转导机制的研究[D];第四军医大学;2004年

6 赵晓利;脂质体转染survivin反义寡核苷酸增加宫颈癌细胞对放、化疗敏感性的实验研究[D];第三军医大学;2005年

7 官立丽;HPV16 E6 siRNA对宫颈癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响[D];四川大学;2005年

8 刘永民;人乳头瘤病毒致癌基因在宫颈癌细胞染色体上的定位及其整合在癌变中的意义[D];中国协和医科大学;1996年

9 郭建新;HPV16 E6-shRNA慢病毒的构建及其对宫颈癌细胞抑制作用研究[D];第三军医大学;2006年

10 刘佳;Hes1/Hes5基因对宫颈癌细胞分化的调节作用及其信号途径的研究[D];浙江大学;2007年

相关硕士学位论文 前10条

1 张文浩;Rab12对宫颈癌细胞放射敏感性的影响及作用机制的初步研究[D];山东大学;2018年

2 陈颖;PRPS2在宫颈癌发生发展中的作用及其机制研究[D];山东大学;2018年

3 周煜;LncRNA HOTAIR通过miR-214调控HPV16型阳性宫颈癌细胞增殖及凋亡的机制研究[D];武汉大学;2018年

4 钱莉莉;子宫颈癌细胞中ΔNp63α的表达机制及Lnc-LIF-AS促进LIF表达的分子机制研究[D];安徽医科大学;2018年

5 程小玲;长链非编码RNA H19在宫颈癌细胞中的生物学功能研究[D];武汉科技大学;2018年

6 郭路路;叶酸对宫颈癌细胞中miR-375及DNMT1表达的影响[D];山西医科大学;2018年

7 毛轶凡;MIR218靶向作用于APC抑制宫颈癌细胞行为的研究[D];皖南医学院;2018年

8 刘诗伶;去氢骆驼蓬碱对宫颈癌的抑制作用及其分子机制研究[D];南昌大学;2018年

9 李佳;缩尺不变性在宫颈癌细胞学筛查中的应用研究[D];南昌航空大学;2015年

10 赵伟;gC1qR基因致宫颈癌细胞凋亡的机制研究[D];南京医科大学;2017年

本文编号：2851068